تحليل السريع للشذوذ الكروموسومات في الخلايا الليمفاوية B الماوس بواسطة PNA-FISH
Summary
مسارات إصلاح الحمض النووي ضرورية لصيانة سلامة الجينوم ومنع الطفرات والسرطان. الهدف من هذا البروتوكول هو لقياس عدم الاستقرار الجيني عن طريق الملاحظة المباشرة للانحرافات في الكروموسومات الطورية ينتشر من خلايا B الماوس باستخدام الفلورسنت الموقع التهجين (FISH) ليكرر DNA الكروموسومات في.
Abstract
إصلاح خلل الحمض النووي يؤدي إلى زيادة عدم الاستقرار الجيني، والذي هو السبب الجذري للطفرات التي تؤدي إلى تكون الأورام. تحليل وتيرة ونوع من الانحرافات الصبغية في أنواع مختلفة من الخلايا يسمح عيوب في مسارات إصلاح الحمض النووي ليتم توضيح. وقد ساعد فهم الثدييات إصلاح الحمض النووي البيولوجيا كثيرا من إنتاج فئران مصابة بالضربة القاضية في جينات معينة. الهدف من هذا البروتوكول هو لقياس عدم الاستقرار الجيني في الخلايا الليمفاوية B الماوس. وضع العلامات على التيلوميرات باستخدام تحقيقات PNA-FISH (ببتيد الحمض النووي – فلوري في الموقع التهجين) يسهل تحليل سريع من عدم الاستقرار الجيني في كروموزوم ينتشر الطورية. خلايا B لديها مزايا نسبية محددة على الخلايا الليفية، لأن لديهم الصيغة الصبغية الطبيعي ومؤشر الإنقسامية العالي. وبالتالي الثقافة على المدى القصير من خلايا B يمكن قياس دقيق من عدم الاستقرار الجيني في السكان الخلية الأساسي الذي من المرجح أن يكون أقل طفرة جينية الثانويةق مما هو عادة موجودة في الخلايا الليفية تتحول أو خطوط الخلايا المرضى.
Introduction
ويتسبب السرطان عن طريق تراكم الطفرات التي تؤثر على الجينات التي تنظم نمو الخلايا العادية. الطفرة هي نتيجة للتغيرات في هيكل وتسلسل الجينوم الناجمة عن الأضرار التي لحقت الحمض النووي. يمكن أن يحدث التلف في الحمض النووي من خلال مجموعة متنوعة من العملية، بما في ذلك العوامل خارجية مثل الإشعاع المؤين، وكناتج نتاج الأيض الخلوي العادي، مثل نزع الأمين التلقائي للقواعد النوكليوتيدات أو ضرر يحدث عن طريق الاتصال مع أنواع الاكسجين التفاعلية 1.
على الرغم من أن خلايا الثدييات تمتلك مجموعة من الأنشطة التي يمكن أن إصلاح الحمض النووي من التلف أو عكس استعادة تسلسل في مواقع انقطاع، مع ذلك الطفرات تتراكم طوال فترة حياة الخلية. التلف في الحمض النووي يمكن أن تساهم علاوة على الشيخوخة وفقدان فاعلية الخلايا الجذعية، وهما العمليات التي ترتبط مع المرض الناجمة عن الشيخوخة 2. فهم إصلاح الحمض النووي من التلف لذلك من أهمية مركزية في معالجة اثنين علامةقضايا ificant في الصحة العامة. تشير أدلة متزايدة على أن الثدييات مسارات إصلاح الحمض النووي يمكن أن تسهم في تطور جينوم الخلايا السرطانية 3،4، مما يزيد من ضرورة لفهم العمليات التي تدخل في قمع طفرة على المستوى الجزيئي.
التصور المباشر من الانحرافات الكروموسومات هي وسيلة قوية وكمية من تحديد مدى عدم الاستقرار الجيني في نوع من الخلايا معين. الكروموسومات المختصرة من الخلايا في الطورية يمكن عزل وتفتيشها باستخدام الضوء أو المجهري الفلورسنت. لقد حققت هذه المناهج الوراثية الخلوية في الممارسة العملية لعدة عقود، ويمكن استخدامها للتدليل على ظهور translocations أو أنواع معينة من الانحرافات الصبغية المرتبطة بفقدان أنشطة إصلاح الحمض النووي. بروتوكول يفسح المجال لعدة ملحقات المحتملة: يمكن أن توصف الكروموسومات مع تحقيقات لتنميط نووي الطيفي (SKY) أو متعدد الألوان فلوري التهجين في الموقع(mFISH) لتحديد translocations 5،6. كما تمكن هذه التقنيات وتيرة translocations الصبغي وهيكل translocations الصبغي معقدة يتم تحديدها، الذي يوفر معلومات إضافية تتجاوز ما هو ممكن مع هذا البروتوكول. بدلا من ذلك، يمكن أن تتولد تحقيقات تسلسل معين وتستخدم لاختبار تردد الكسر DNA في مواقع الجينومية اختيار 7.
في هذا البروتوكول، ونحن تصف إعداد كروموسوم الطورية ينتشر من الخلايا الليمفاوية B. يستخدم الببتيد حمض النووي (PNA) التحقيق fluorescently المسمى ليكرر الكروموسومات، الذي يصادف التيلوميرات بكفاءة في كروموسوم الطورية ينتشر هذا البروتوكول لديه العديد من المزايا. خلايا B يمكن أن يتسبب في النمو في مؤشر الإنقسامية عالية جدا، بحيث يمكن أن تنتج باستمرار هوامش عالية الجودة. خلايا B من الفئران المعدلة وراثيا هي أيضا أقل احتمالا لاحتواء الطفرات الوراثية الثانوية التي يمكن أن نخلط تحليل مساهمة كبيرةجينات محددة لسلامة الجينوم. يمكن أن تكتمل النهج PNA-FISH في يوم واحد، ويسمح التهديف أكثر دقة من الاعفاءات كروموسوم. باستخدام هذا النهج، وخاصة في تركيبة مع معدات معينة الموصوفة في هذا البروتوكول، فمن الممكن لإنتاج متسقة للغاية، وينتشر عالية الجودة وتحليل بسرعة معدل ونوع من عدم الاستقرار الجيني.
Protocol
Representative Results
Discussion
بينما هي مناسبة خاصة الخلايا الليمفاوية B المنشط لإعداد ينتشر كروموسوم الإنقسامية، أنواع الخلايا الأخرى يمكن أن تستخدم أيضا. الخلايا اللمفية تي تشترك العديد من مزايا خلايا B، حيث يمكن تنقيته من الطحال أو الغدد الليمفاوية، ولها مؤشر الإنقسامية عالية عندما حفز النمو ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح R00 CA160574 (SFB) وزمالة من برنامج التدريب التكنولوجيا الحيوية روتجرز (إلى SMM).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50% Dextran sulfate | Intergen | S4030 | |
| Deionized formamide | Ambion | 9342 | |
| Pepsin (5g) | Sigma | P 6887 | |
| FCS | Gemini | 100-106 | |
| LPS (100mg) | Sigma | L2630 | |
| IL-4 (5μg) | Sigma | I1020 | |
| PNA Telomere Probe | PNA Bio Inc | F1002 | (CCCTAACCCTAACCCTAA) |
| Colcemid | Roche | 295892 | |
| Mowiol 4-88 | Sigma | 81381-50g | |
| CD43 (ly-48_) micro-beads | Miltenyl Biotec. | 130-049-801 | |
| DAPI | Sigma | 32670-5MG | |
| Eclipse E800 | Nikon | ||
| AxioImager.Z2 | Zeiss | ||
| CDS-5 Cytogenetic Drying Chamber | Thermotron |
References
- Sancar, A., Lindsey-Boltz, L. A., Unsal-Kacmaz, K., Linn, S. Molecular mechanisms of mammalian DNA repair and the DNA damage checkpoints. Ann Rev Biochem. 73, 39-85 (2004).
- Sperka, T., Wang, J., Rudolph, K. L. DNA damage checkpoints in stem cells, ageing and cancer. Nature reviews Mol Cell Biol. 13 (9), 579-590 (2012).
- Alexandrov, L. B., et al. Signatures of mutational processes in human cancer. Nature. 500 (7463), 415-421 (2013).
- Bunting, S. F., et al. 53BP1 inhibits homologous recombination in Brca1-deficient cells by blocking resection of DNA breaks. Cell. 141 (2), 243-254 (2010).
- Padilla-Nash, H. M., Barenboim-Stapleton, L., Difilippantonio, M. J., Ried, T. Spectral karyotyping analysis of human and mouse chromosomes. Nat Protoc. 1 (6), 3129-3142 (2006).
- Callen, E., et al. Chimeric IgH-TCRalpha/delta translocations in T lymphocytes mediated by RAG. Cell Cycle. 8 (15), 2408-2412 (2009).
- Boboila, C., et al. Alternative end-joining catalyzes robust IgH locus deletions and translocations in the combined absence of ligase 4 and Ku70. Natl Acad Sci USA. 107 (7), 3034-3039 (2010).
- Benn, P., Delach, J. Human lymphocyte culture and chromosome analysis. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Metaphase spreads and spectral karyotyping of human embryonic stem cells. Cold Spring Harb Protoc. 2008, (2008).
- Schreck, R. R., Disteche, C. M. Chapter 4. Chromosome banding techniques. Unit 2, (2001).
- Gilley, D., et al. DNA-PKcs is critical for telomere capping. Proc Natl Acad Sci USA. 98 (26), 15084-15088 (2001).
- Bolzan, A. D. Chromosomal aberrations involving telomeres and interstitial telomeric sequences. Mutagenesis. 27 (1), 1-15 (2012).
- Bolzan, A. D., Telomeres Bianchi, M. S. interstitial telomeric repeat sequences and chromosomal aberrations. Mutat Res. 612 (3), 189-214 (2006).
- Poon, S. S., Lansdorp, P. M. Chapter 18. Quantitative fluorescence in situ hybridization (Q-FISH). Unit 18 14, (2001).
- Morales, J. C., et al. 53BP1 and p53 synergize to suppress genomic instability and lymphomagenesis. Proc Natl Acad Sci USA. 103 (9), 3310-3315 (2006).
- Halaby, M. J., et al. Synergistic interaction of Rnf8 and p53 in the protection against genomic instability and tumorigenesis. PLoS Genet. 9 (1), e1003259 (2013).
