Snelle analyse van chromosoomafwijkingen in Muis B-lymfocyten door PNA-FISH

Kanker wordt veroorzaakt door de accumulatie van mutaties die genen die normale celgroei reguleren. Mutatie is een gevolg van veranderingen in de structuur en sequentie van het genoom veroorzaakt door beschadiging van DNA. DNA schade kan ontstaan ​​door een verscheidenheid van proces, waaronder exogene middelen zoals ioniserende straling, en als een bijproduct van normale cellulaire metabolisme zoals spontane deaminatie van nucleotide basen of schade ontstaat contact met reactieve zuurstof species ^1.

Hoewel zoogdiercellen een scala aan reparatie activiteiten die DNA-schade kan terugdraaien of herstellen van de volgorde bij breuk locaties bezitten, mutaties toch verzamelen gedurende de levensduur van een cel. DNA schade kan bovendien bijdragen tot senescentie en verlies van vermogen van stamcellen, twee processen die zijn geassocieerd met veroudering geassocieerde ziekte ^2. Inzicht in de reparatie van DNA-schade is daarom van vitaal belang voor het aanpakken van twee tekenificant vraagstukken in volksgezondheid. Meer gegevens suggereren dat zoogdier-DNA herstelmechanismen kan bijdragen aan de evolutie van de kankercel genoom ^3,4, waardoor het nog noodzakelijk om de bij het ​​onderdrukken mutatie op moleculair niveau processen te begrijpen.

Directe visualisatie van chromosoomafwijkingen is een krachtige en kwantitatieve wijze bepalen van de mate van genomische instabiliteit in een bepaald celtype. Gecondenseerde chromosomen uit cellen in metafase kan worden geïsoleerd en geïnspecteerd door licht of fluorescentiemicroscopie. Dergelijke cytogenetische benaderingen in de praktijk al tientallen jaren en kan worden gebruikt om het uiterlijk van translocaties of specifieke types chromosoomafwijkingen aan een verminderde DNA reparatiewerkzaamheden tonen. Het protocol leent zich voor verschillende potentiële extensies: chromosomen kunnen met probes voor spectrale karyotypering (SKY) of meerkleurige fluorescerende in situ hybridisatie worden geëtiketteerd(MFISH) om translocaties ^5,6 identificeren. Deze technieken de frequentie van chromosoom translocaties en de structuur van complexe chromosoom translocaties te bepalen, die aanvullende informatie biedt dan wat er mogelijk is met dit protocol in te schakelen ook. Alternatief kunnen sequentie-specifieke probes gegenereerd en gebruikt om de frequentie van DNA breuken testen geselecteerde genome locaties ^7.

In dit protocol beschrijven we bereiding van metafase chromosoom spreads van B lymfocyten. Een fluorescentie-gemerkt peptide nucleïnezuur (PNA) probe voor telomeer herhalingen gebruikt, die efficiënt merken telomeren in metafase chromosoom spreads Dit protocol heeft verschillende voordelen. B-cellen kunnen worden geïnduceerd te groeien bij hoge mitotische index zodat hoogwaardige spreads logischerwijze kan worden geproduceerd. B-cellen van genetisch gemodificeerde muizen zijn ook veel minder waarschijnlijk secundaire genetische mutaties die de analyse van de bijdrage kan verwarren bevattenspecifieke genen genomische integriteit. De PNA-FISH aanpak kan in een dag worden afgerond, en maakt het mogelijk nauwkeuriger scoring van chromosoom breekt. Door deze benadering, met name in combinatie met specifieke apparatuur beschreven in dit protocol is het mogelijk om zeer consistent hoge kwaliteit spreads produceren en snel analyseren de snelheid en aard van genomische instabiliteit.