多孔質フィルタを使用した生化学分析のための感覚ニューロンからの軸索の産生および単離
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
神経細胞の軸索の区画は、体性樹状区画から機能的自立度が大きく表示されます。投射ニューロンでは、軸索は、神経タンパク質1,2のほとんどが含まれています。最近の研究では、早期の軸索の機能障害は、神経変性疾患や精神神経疾患3の共通の特徴であるように思われることが示されているので、軸索の生理学および病態生理学の研究では、神経科学のコミュニティで勢いを得ています。これは、正常および病的条件下における軸索独占的メカニズムのよりよい理解が機能障害を運転初期事象を解明する可能性が高いようです。
この議定書は、生物化学的に適しており、免疫細胞化学分析の純粋な軸索材料を大量に取得するために多孔質膜（フィルター）を有する培養インサートを使用する方法について説明します。軸索生物学を研究するためのフィルターインサートの使用は、最初のスチュワードによって実装され、同僚4、さらにその現在の構成にトウィスと同僚5によって開発された。技術が研究されたニューロンの集団に対応するために、それぞれの場合にわずかな変更を加えて、軸索と樹状突起生物学のさまざまな側面を研究するグループによる、現在使用中である、行わトリートメント、生化学的分析のタイプは6-9を使用していました。この議定書は、アプリケーションのような様々なすべての選択肢に対応するつもりではなく、ほとんどのアプリケーションに適しています簡単な方法を提供していません。具体的には、ここで説明するプロトコルは、撤回し、栄養因子9から奪わとき速く退化少ない軸索を生産生化学分析のための軸索の歩留まりを最大化し、文献に記載された軸索変性、他のコーティングを勉強するのに最適であるトリプルコーティングを使用しています。
この手順では、神経細胞体は、フィルターの上に分離されたままのWHパリの軸索は、孔を通過し、その底面に沿って成長する。フィルタの下面に成長する（グリアおよびニューロン細胞体の混入物を含まない）純粋な軸索 は、生化学分析のために収集することができ、またはその場で固定し、免疫細胞化学的技法9により調べることができる。手順は、後根神経節（DRG）からの胚性感覚ニューロンの使用に依存している。神経成長因子（NGF）に維持するとき、これらの細胞からの神経突起は、インビトロで迅速かつ強固な増殖を受けるので、この要因を奪われたとき、彼らは急速に変性を受けるため、胚性DRGを広く軸索の生物学を研究するために使用される。この方法で収集されたすべての神経突起は、純粋に軸索になるように、また、DRGニューロンは、樹状突起を欠いている。
フィルタインサートは、軸索を研究するために使用される他のアプローチに比べて大きな利点を示す。 Aのものとは細胞体で発生するプロセスを区別するために顕微鏡を使用することに頼った研究xonsは、限られた生化学的な情報を提供します。別の例として、区画化培養システム（ 例えば 、Campenotチャンバー10又はマイクロ流体デバイス11）は、撮像アプローチのためおよび細胞区画の差分治療に有用であるが、軸索の材料を少量しか提供し、必要とする生化学的分析のためのこれらの技術の使用を排除する試料の比較的大量。また、それらの使用はかなりの訓練並びに特殊な装置を必要とし、それらは時間がかかる。多くの場合、外植片からの軸索を単離するために使用される別のアプローチは、手動で、軸索試料収集の前に（ニューロン細胞体を含む）を外植片の中心部を除去することである。これは軸索に富む準備を大量に生成することができますが、この準備の軸索は、グリアに包まれ、急速に連続して（最小限の実験の例として）6ウェルから20外植片の本体を取り外すことができ、時間がかかり、実現可能性の限界にある。
対照的に、ここに示された方法は、次いで、ウェスタンブロット、免疫沈降6、ノーザンブロット5質量分析計6、RNA精製の ような一般的に全細胞溶解物を分析するために使用される実質的に任意の生化学的手法で分析することができ、豊かで純粋な軸索 の製剤を生成する7,12,13等が挙げられる。それはさらに、IFによってそれらを調べるために、フィルタの下側で成長する軸索を固定することができるように、また、このプロトコルは、免疫蛍光（IF）技術を適用することができる。ない細胞体は、最終的な準備ではありませんので、このアプローチは、大幅に軸索固有のプロセスの分析を容易にします。細胞体からの高免疫蛍光信号は、多くの場合、軸索のような薄い構造から生じる弱い信号の検査および分析を損なうので、これは重要な利点である。
軸索変性ARを研究する培養方法の2つのアプリケーションE説明し;発達剪定や損傷誘発変性のモデルのモデルは、（一般的にウォーラー変性と呼ばれる）。発達剪定のモデル化は、 生体内での感覚ニューロンがターゲット由来のNGFの量を制限し、それらが十分な栄養サポート縮退14の受信に失敗のために競争するという事実に基づいています。この現象は、インビボで起こるように、細胞体の破壊に続いて軸索変性を開始し、培養培地からNGFを引き出すことによって、胚DRG培養物に模倣することができる。ウォーラー変性をモデル化するために、細胞体を持つフィルタの上面が削り取られている。物理的に細胞体から分離し、その後、最初の1850年16現象を報告したA. Wallerの名にちなんで名付けウォーラー変性症15、として知られている迅速かつステレオタイプ変性過程を経るとなり、フィルタの下側に成長していた軸索。
Protocol
Representative Results
Discussion
この技術を適応させる際に考慮すべき重要なパラメータは、検討するニューロン集団は、基板、フィルターの細孔径および表面積を含む。これらのすべてのパラメータが得られ、神経突起の準備の特異性、質と量に影響を与える、とエンドユーザーが慎重に検討されなければならない。このプロトコルで示す実施例では、DRGニューロンの使用は、純粋な（特定の）軸索の製剤を与えるだけ軸?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
References
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