Productie en isolatie van axonen van sensorische neuronen voor Biochemische analyse met behulp van poreuze filters
Summary
This article describes a neuronal culture system that can be used to obtain large quantities of pure axonal samples for biochemical and immunocytochemical analyses. This technique will allow an improved understanding of normal axonal physiology and signaling pathways leading to neurodegeneration.
Abstract
Neuronal axons use specific mechanisms to mediate extension, maintain integrity, and induce degeneration. An appropriate balance of these events is required to shape functional neuronal circuits. The protocol described here explains how to use cell culture inserts bearing a porous membrane (filter) to obtain large amounts of pure axonal preparations suitable for examination by conventional biochemical or immunocytochemical techniques. The functionality of these filter inserts will be demonstrated with models of developmental pruning and Wallerian degeneration, using explants of embryonic dorsal root ganglion. Axonal integrity and function is compromised in a wide variety of neurodegenerative pathologies. Indeed, it is now clear that axonal dysfunction appears much earlier in the course of the disease than neuronal soma loss in several neurodegenerative diseases, indicating that axonal-specific processes are primarily targeted in these disorders. By obtaining pure axonal samples for analysis by molecular and biochemical techniques, this technique has the potential to shed new light into mechanisms regulating the physiology and pathophysiology of axons. This in turn will have an impact in our understanding of the processes that drive degenerative diseases of the nervous system.
Introduction
De axonale compartiment van neuronen toont een grote mate van functionele onafhankelijkheid van de somato-dendritische compartiment. In projectie neuronen, axonen bevatten meeste neuronale proteïne 1,2. Het onderzoek van de fysiologie en pathofysiologie van axonen heeft impuls in de neurowetenschappen gekregen omdat recente studies hebben aangetoond dat vroege axonale disfunctie lijkt een gemeenschappelijk kenmerk van neurodegeneratieve ziekten en neuropsychiatrische stoornissen 3 zijn. Het lijkt waarschijnlijk dat een beter begrip van axonale-exclusieve mechanismen onder normale en pathologische omstandigheden licht zal werpen op de vroege gebeurtenissen die dysfunctie rijden.
Het huidige protocol beschrijft hoe cultuur inserts te gebruiken, voorzien van een poreus membraan (filter) om grote hoeveelheden zuivere axonale materiaal dat geschikt is voor biochemische en immunocytochemische analyses te verkrijgen. Het gebruik van de filter voegt studeren axonale biologie werd voor het eerst uitgevoerd door Steward encollega's 4 en verder ontwikkeld door Twiss en collega's 5 tot zijn huidige configuratie. De techniek is nu in het huidige gebruik door groepen te bestuderen verschillende aspecten van axonen en dendrieten biologie, met lichte wijzigingen in elk geval geschikt voor de bevolking van neuronen bestudeerd, de behandelingen uitgevoerd en de aard van biochemische analyses gebruikt 6-9. Het huidige protocol is niet van plan om alle alternatieven voor een dergelijke verscheidenheid aan toepassingen tegemoet te komen, maar eerder een eenvoudige aanpak die geschikt is voor de meeste toepassingen. Met name de hier beschreven protocol gebruikt een drievoudige coating die axonale opbrengst biochemische analyses maximaliseert en het meest geschikt is axonale degeneratie andere coatings die in de literatuur beschreven onderzoeken geproduceerd minder axonen die ingetrokken en degenereren sneller wanneer beroofd van trofische factoren 9.
In deze procedure blijven neuronale cellichamen geïsoleerd bovenop de filter while axonen passeren de poriën en groeien langs de onderkant. Zuiver axonen (vrij van glia en neuronale cellichaam verontreinigingen) die groeien op het onderoppervlak van het filter kan worden verzameld voor biochemische analyse of kunnen in situ worden vastgesteld en immunocytochemische technieken 9 onderzocht. De procedure is gebaseerd op het gebruik van embryonale sensorische neuronen in de dorsale wortel ganglia (DRG). Embryonale DRG worden veel gebruikt om axonale biologie studeren omdat neurieten uit deze cellen ondergaan snelle en robuuste groei in vitro als gehandhaafd zenuwgroeifactor (NGF), en omdat zij snel degeneratie ondergaan wanneer beroofd van deze factor. Ook DRG neuronen missen dendrieten, zodat de door deze methode verzameld neurieten zuiver axonen.
Inserts filter vertegenwoordigen een groot voordeel in vergelijking met andere benaderingen gebruikt om axonen bestuderen. Studies die gebruikmaken van microscopie onderscheiden processen in de cel soma dan in eenXON bieden beperkte biochemische informatie. Als een ander voorbeeld, verzuilde cultuur systemen (bijvoorbeeld, Campenot kamers 10 of microfluïdische apparaten 11) zijn nuttig voor de beeldvorming benaderingen en voor de verschillende behandeling van celcompartimenten maar bieden slechts kleine hoeveelheden axonale materiaal, zich verzet tegen het gebruik van deze technieken voor biochemische analyses die vereisen dat relatief grote hoeveelheden monster. Verder, het gebruik ervan vereist aanzienlijke opleiding en gespecialiseerde apparatuur, en ze zijn tijdrovend. Een andere benadering vaak gebruikt om axonen isoleren van explantaten is om een explantatie centrum (met neuronale cellichamen) handmatig verwijderen voordat axonale monstername. Hoewel grote hoeveelheden van axon verrijkte preparaten kunnen produceren, kunnen axonen in dit preparaat worden gehuld in glia en snel organen 20 explantaat's verwijderd uit de reeks van 6 putjes (als een voorbeeld van een minimale experiment) is tijdrovend en op de grens van uitvoerbaarheid.
In tegenstelling, de hier gepresenteerde methode geeft veel en zuiver axonale preparaten die vervolgens kunnen worden geanalyseerd door vrijwel elke biochemische techniek die algemeen wordt gebruikt om volledige-cellysaten te analyseren, zoals western blot, immunoprecipitatie 6, Northern blot 5 massaspectrometrie 6, RNA zuivering 7,12,13, onder anderen. Bovendien kan het protocol worden toegepast (IF) immunofluorescentie technieken, aangezien het mogelijk is om axons groeien in de onderzijde van het filter om deze verder te onderzoeken IF lossen. Deze benadering vergemakkelijkt aanzienlijk de analyse van axonale specifieke werkwijzen omdat er geen cellichamen in het uiteindelijke preparaat. Dit is een belangrijk voordeel omdat een hoge immunofluorescente signaal van cellichamen ondermijnt vaak onderzoek en analyse van een zwakker signaal afkomstig dunne structuren zoals axonen.
Twee toepassingen van de kweekmethode tot axonaledegeneratie ar studerene beschreven; een model van ontwikkelings snoeien en een model van letsel-geïnduceerde degeneratie (meestal aangeduid als Wallerian degeneratie). Het modelleren van ontwikkelings snoeien is gebaseerd op het feit dat sensorische neuronen in vivo concurreren beperking hoeveelheden doelsoorten afgeleide NGF en die niet genoeg neurotrofe steun gedegenereerde 14 ontvangen. Dit verschijnsel kan in embryonale DRG culturen worden nagebootst door intrekking NGF uit het kweekmedium, die, zoals in vivo, initieert axonale degeneratie gevolgd door cellichaam vernietiging. Om Wallerian degeneratie modelleren, wordt de bovenkant van het filter met de cellichamen weggeschraapt. De axonen dat op de bodem van het filter worden fysiek gescheiden van de cellichamen en daarna ondergaan een snelle en stereotiep degeneratieve proces dat bekend staat als Wallerian degeneratie 15, vernoemd naar A. Waller die het eerst melding gemaakt van het fenomeen in 1850 16 was gegroeid.
Protocol
Representative Results
Discussion
Belangrijke parameters rekening te houden bij de aanpassing van deze techniek zijn de neuronale populatie die wordt onderzocht, het substraat poriegrootte van het filter oppervlak. Al deze parameters zullen invloed hebben op de specificiteit, kwaliteit en kwantiteit van de neuriet voorbereiding verkregen, en moet zorgvuldig worden overwogen door de eindgebruiker. In de voorbeelden in dit protocol, het gebruik van DRG neuronen heeft het voordeel uitstrekkende slechts axons, waardoor een zuivere (specifieke) axonale voorb…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This project was supported by grant MOP62827 from the Canadian Institutes of Health Research.
Materials
| CD-1 mouse, E13 timed pregnancy | Charles River | In house timed pregnancies can be done by mating mice and checking for vaginal plugs (Day E0) | |
| Falcon Cell Culture Inserts | Corning | 353102 | 1 µm pore size, fits 6-well receiving plate |
| Falcon Cell Culture Companion Plates | Corning | 353502 | Receiving plates for inserts |
| Poly-D-Lysine | Sigma-Aldrich | P6407 | Used at 1 mg/ml in water. Can re-use once. |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L2020 | Used at 10 ug/ml in water. Take 100X stock from -80 °C and thaw overnight at 4 °C |
| PureCol Bovine Collagen Solution | Advanced Biomatrix | 5005-B | |
| Leibovitz's L-15 Medium | Invitrogen | 11415-064 | Can be replaced by DMEM. |
| Neurobasal Medium | Invitrogen | 21103-049 | |
| B-27 Serum-Free Supplement | Invitrogen | 17504-044 | |
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine (FDU) | Sigma-Aldrich | F0503 | |
| NGF (2.5S, beta subunit) | Cedarlane | CLMCNET-001 | |
| Anti-NGF Antibody | Prepared in-house | – | As described in: Acheson, A., Barker, P.A., Alderson, R.F., Miller, F.D. & Murphy, R.A. Detection of brain-derived neurotrophic factor-like activity in fibroblasts and Schwann cells: inhibition by antibodies to NGF. Neuron.7, 265-75, (1991) |
| Alomone Labs | AN-240 | Commercial option | |
| Anti-Tubulin Antibody | Millipore | MAB5564 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Mouse Antibody | Invitrogen | A-11029 | |
| DRG culture medium | |||
| Neurobasal Medium 2 % B27 Neurobasal Supplement 2 mM l-Glutamine 1 % Penicillin-Streptomysin 10 µM FDU 15 ng/ml NGF (bottom compartment only) |
|||
| 1X Laemmli Sample Buffer | |||
| 10 % SDS 0.5 M DTT 0.5 M Tris (pH 6.8) 5 % Glycerol 0.01 % (w/v) Bromophenol blue |
References
- Conde, C., Caceres, A. Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites. Nat. Rev. Neurosci. 10, 319-332 (2009).
- Rasband, M. N. The axon initial segment and the maintenance of neuronal polarity. Nat. Rev. Neurosci. 11, 552-562 (2010).
- Lingor, P., Koch, J. C., Tonges, L., Bahr, M. Axonal degeneration as a therapeutic target in the CNS. Cell Tissue Res. 349, 289-311 (2012).
- Torre, E. R., Steward, O. Demonstration of local protein synthesis within dendrites using a new cell culture system that permits the isolation of living axons and dendrites from their cell bodies. J. Neurosci. 12, 762-772 (1992).
- Zheng, J. Q., et al. A functional role for intra-axonal protein synthesis during axonal regeneration from adult sensory neurons. J. Neurosci. 21, 9291-9303 (2001).
- Willis, D., et al. Differential transport and local translation of cytoskeletal, injury-response, and neurodegeneration protein mRNAs in axons. J. Neurosci. 25, 778-791 (2005).
- Poon, M. M., Choi, S. H., Jamieson, C. A., Geschwind, D. H., Martin, K. C. Identification of process-localized mRNAs from cultured rodent hippocampal neurons. J. Neurosci. 26, 13390-13399 (2006).
- Schoenmann, Z., et al. Axonal degeneration is regulated by the apoptotic machinery or a NAD+-sensitive pathway in insects and mammals. J. Neurosci. 30, 6375-6386 (2010).
- Unsain, N., Higgins, J. M., Parker, K. N., Johnstone, A. D., Barker, P. A. XIAP regulates caspase activity in degenerating axons. Cell Rep. 4, 751-763 (2013).
- Ure, D. R., Campenot, R. B. Retrograde transport and steady-state distribution of 125I-nerve growth factor in rat sympathetic neurons in compartmented cultures. J. Neurosci. 17, 1282-1290 (1997).
- Taylor, A. M., et al. Axonal mRNA in uninjured and regenerating cortical mammalian axons. J. Neurosci. 29, 4697-4707 (2009).
- Minis, A., et al. Subcellular transcriptomics-Dissection of the mRNA composition in the axonal compartment of sensory neurons. Dev. Neurobiol. , (2013).
- Niekerk, E. A., et al. Sumoylation in axons triggers retrograde transport of the RNA-binding protein La. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 12913-12918 (2007).
- Huang, E. J., Reichardt, L. F. Neurotrophins: roles in neuronal development and function. Annu. Rev. Neurosci. 24, 677-736 (2001).
- Vargas, M. E., Barres, B. A. Why is Wallerian degeneration in the CNS so slow. Annu. Rev. Neurosci. 30, 153-179 (2007).
- Waller, A. Experiments on the Section of the Glossopharyngeal and Hypoglossal Nerves of the Frog, and Observations of the Alterations Produced Thereby in the Structure of Their Primitive Fibres. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. 140, 423-429 .
- Albuquerque, C., Joseph, D. J., Choudhury, P., MacDermott, A. B. Dissection, Plating, and Maintenance of Dorsal Root Ganglion Neurons for Monoculture and for Coculture with Dorsal Horn Neurons. Cold Spring Harbor Protocols. , (2009).
- Leach, M. K., et al. The culture of primary motor and sensory neurons in defined media on electrospun poly-L-lactide nanofiber scaffolds. J Vis Exp. (48), (2011).
- Sasaki, Y., Araki, T., Milbrandt, J. Stimulation of nicotinamide adenine dinucleotide biosynthetic pathways delays axonal degeneration after axotomy. J. Neurosci. 26, 8484-8491 (2006).
