Протокол заразить<em> Caenorhabditis Элеганс</em> С<em> Сальмонелла Typhimurium</em
Summary
C. Элеганс стала новой генетической модели для изучения хост-патогенных взаимодействий. Здесь мы опишем протокол заразить C. Элеганс с Salmonella Typhimurium в сочетании с техникой помех РНК-интерференции двухцепочечной изучить роль генов хозяина в защите от сальмонеллезной инфекции.
Abstract
В последнее десятилетие, С. Элеганс стала беспозвоночных организма для изучения взаимодействий между хозяевами и патогенов, в том числе защите организма против грамотрицательных бактерий Salmonella Typhimurium. Сальмонелла устанавливает хронической инфекции в кишечнике С. Элеганс и приводит к ранней смерти инфицированных животных. Ряд механизмов иммунитета были выявлены в С. Элеганс защититься от сальмонеллы инфекций. Аутофагия, эволюционно консервативными деградация лизосомного пути, как было показано, ограничить репликацию Salmonella в С. Элеганс и у млекопитающих. Здесь, протокол описывается заразить C. Элеганс с Salmonella Typhimurium, в котором черви подвергаются Salmonella в течение ограниченного времени, подобно сальмонеллезной инфекции у человека. сальмонеллы инфекция значительно сокращает продолжительность жизни C. Элеганс </ EM>. Использование основного гена аутофагии ОЦК-1 в качестве примера, мы объединили этот метод инфекции с C. Элеганс РНК-интерференции кормления подход и показал этот протокол может быть использован для изучения функцию C. Элеганс генов хозяина в защите от сальмонеллезной инфекции. Поскольку С. Элеганс целого генома RNAi библиотеки доступны, этот протокол позволяет всесторонне скрининга С. Элеганс гены, которые защищают от сальмонеллы и других кишечных патогенов с использованием генома RNAi библиотеки.
Introduction
Свободно живущих нематод почвы Caenorhabditis Элеганс является простым и генетически послушный модель организма используется для изучения многих биологических вопросы. С. Элеганс преимущественно существует как самоопыляющихся гермафродитов. Самцы спонтанно генерируется нерасхождения Х-хромосомы во время гаметогенеза 1,2. При наличии обильной пищи, C. Элеганс постоянно развивать через четыре личиночной стадии к взрослым. Температура также влияет на С. развитие Элеганс; быстрое развитие наблюдается при более высоких температурах. В лаборатории С. Элеганс культивируют при стандартной температуре 20 ° С на чашках с сеяной бактерия кишечной палочки (штамм OP50) в качестве пищи 1,2.
В последнее десятилетие, С. Элеганс стала беспозвоночных организма для изучения хост-патогенных взаимодействий 3-5. В природе C. Элеганс питается бактериями, как его Нутриэнт Источник 1,2. Его нормальное бактериальная лаборатория пищевой, OP50, могут быть легко заменены другими патогенами изучить взаимодействие между С. Элеганс и любой выбранной патоген. В этих условиях, кишечник является основной сайт инфекции. В самом деле, широкий спектр бактериальных патогенов, как было показано смертельно заразить C. Элеганс 3-5.
Грамотрицательная бактерия сальмонелла является желудочно-патогенный микроорганизм, который вызывает человеческую болезней пищевого происхождения во всем мире 6,7. С. Элеганс является хорошей моделью хост для Salmonella Typhimurium как эта бактерия размножается и имеет постоянные кишечных инфекций 8-10. С. Элеганс был использован для идентификации как роман и ранее известный Сальмонелла факторов вирулентности 11. Интересно, что С. Элеганс иммунная система успешно ограничивает Salmonella репликацию. Сообщалось ранее, что inhibition генов аутофагии оказывает повышенную репликацию Salmonella в С. Элеганс, в результате ранней смерти зараженных червями 10. Macroautophagy (далее по тексту аутофагии) представляет собой динамичный процесс, включающий перестройку субклеточных мембран поглощать цитоплазму и органеллы для доставки в лизосомы для деградации 12. Аутофагия сообщалось ограничить репликацию Salmonella в С. Элеганс и у млекопитающих 10,13.
С. Элеганс геном был первый многоклеточный генома эукариот последовательность; это ответ на РНК-интерференции лечения 14-16. Кроме того, RNAi можно вводить эффективно при условии червей глотать бактерии, содержащие двухцепочечную РНК гена-мишени, известный как RNAi кормления 16,17. Весь геном РНК-интерференции библиотеки кормления были получены для генома РНК-интерференции скрининга 16,18. Здесь, сальмонеллы инфекция протокол соединен с РНК-интерференции кормления, чтобы тестирование C. Элеганс гены интереса для их способности защиты от сальмонеллезной инфекции.
Protocol
Representative Results
Discussion
С. Элеганс является простым генетическая модель организм, который питается бактериями качестве источника питательных веществ. Таким образом, можно легко заменить его нормальной бактериальной пищи с кишечным патогеном исследовать взаимодействие между С. Элеганс и выбрали п?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Дайан Баронас-Лоуэлла за критическое прочтение рукописи. Эта работа была поддержана FAU Charles E. Schmidt колледжа науки семян Грант и стареющего стипендии от Эллисона Медицинский фонд в KJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
- Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
- Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
- Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
- Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- . The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
- Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
- Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
- Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).
