Summary

Un protocole d'infecter<em> Caenorhabditis elegans</em> Avec<em> Salmonella typhimurium</em

Published: June 26, 2014
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Summary

C. elegans a émergé comme un nouveau modèle génétique pour étudier les interactions hôte-pathogène. Ici, nous décrivons un protocole pour infecter C. elegans avec Salmonella typhimurium couplé avec la technique d'interférence double-brin ARNi pour étudier le rôle des gènes de l'hôte dans la défense contre l'infection à Salmonella.

Abstract

Dans la dernière décennie, C. elegans est devenu un organisme invertébré pour étudier les interactions entre hôtes et pathogènes, y compris la défense de l'hôte contre les bactéries gram-négatif bactérie Salmonella typhimurium. Salmonella établit une infection persistante dans l'intestin de C. elegans et entraîne la mort précoce des animaux infectés. Un certain nombre de mécanismes de l'immunité ont été identifiés en C. elegans pour se défendre contre les infections à Salmonella. Autophagy, une voie de dégradation lysosomale évolutif conservé, a été montré pour limiter la réplication de Salmonella dans C. elegans et chez les mammifères. Ici, un protocole est décrit à infecter C. elegans avec Salmonella typhimurium, dans laquelle les vers sont exposés à Salmonella pendant une durée limitée, semblable à une infection à Salmonella chez l'homme. infection à Salmonella raccourcit considérablement la durée de vie de C. elegans </ Em>. Utilisation du gène de l'autophagie essentiel bec-1, par exemple, nous avons combiné cette méthode d'infection à C. elegans ARNi alimentation approche et montré ce protocole peut être utilisé pour examiner la fonction de C. gènes de l'hôte elegans dans la défense contre l'infection à Salmonella. Depuis C. elegans génome des bibliothèques entières de RNAi sont disponibles, ce protocole permet à l'écran complètement pour C. gènes elegans qui protègent contre les salmonelles et d'autres agents pathogènes intestinaux utilisant des bibliothèques de l'ARNi du génome entier.

Introduction

Le nématode du sol vivant librement Caenorhabditis elegans est un organisme simple et génétiquement traitable modèle utilisé pour étudier plusieurs questions biologiques. C. elegans existe dominante comme hermaphrodites auto-fertilisation. Les mâles sont spontanément générées par des non-disjonction du chromosome X durant la gamétogenèse 1,2. En présence d'une alimentation abondante, C. elegans développer en continu à travers quatre stades larvaires à l'âge adulte. La température influe aussi C. développement elegans; On observe un développement plus rapide à des températures plus élevées. En laboratoire, C. elegans est cultivé à une température standard de 20 ° C sur gélose ensemencée avec la bactérie Escherichia coli (souche OP50) que la nourriture 1,2.

Dans la dernière décennie, C. elegans est devenu un organisme invertébré pour étudier les interactions hôte-pathogène 3-5. Dans la nature, C. elegans mange des bactéries comme nutrient la source 1,2. Sa nourriture de laboratoire bactérienne normale, OP50, peut être facilement remplacé par d'autres agents pathogènes d'étudier les interactions entre C. elegans et n'importe quel agent pathogène choisi. Dans ces conditions, l'intestin est le site primaire de l'infection. En effet, une large gamme de pathogènes bactériens a été montré pour infecter léthalement C. elegans 5.3.

La bactérie Salmonella Gram négatif est un agent pathogène gastro-intestinal qui provoque une maladie d'origine alimentaire humaine dans le monde 6,7. C. elegans est un bon hôte de modèle pour Salmonella typhimurium que cette bactérie se réplique et présente infections intestinales persistantes 8-10. C. elegans a été utilisé pour identifier à la fois roman et les facteurs précédemment connu virulence de Salmonella 11. Fait intéressant, l'C. système immunitaire elegans limite efficacement la réplication de la bactérie Salmonella. Il a été rapporté précédemment que inhibition des gènes de l'autophagie rend réplication accrue de Salmonella dans C. elegans, entraînant la mort précoce de vers infectées 10. Macroautophagie (ci-après appelé autophagie) est un processus dynamique impliquant le réarrangement des membranes intracellulaires de séquestrer cytoplasme et des organites pour la livraison vers le lysosome pour dégradation 12. Autophagy a été rapportée pour limiter la réplication de Salmonella dans C. elegans et chez les mammifères 10,13.

Le C. génome elegans a été le premier génome eucaryote multicellulaire séquencé; il est sensible à l'ARNi traitement 14-16. En outre, l'ARNi peut être administré efficacement en soumettant les vers à ingérer des bactéries contenant de l'ARN à double brin du gène cible, connu sous le nom de RNAi alimentation 16,17. Bibliothèques d'alimentation ARNi du génome entier ont été générés pour l'ARNi du génome de dépistage 16,18. Ici, une infection pro Salmonellaprotocole est couplé avec l'ARNi alimentation pour permettre de tester C. gènes elegans d'intérêt pour leur capacité à protéger contre l'infection à Salmonella.

Protocol

1. XLD (xylose-lysine-désoxycholate) des plaques de gélose gélose XLD est un milieu de croissance sélective de Salmonella, qui apparaît comme des colonies noires sur des plaques de gélose XLD. Toutefois, s'il n'y a pas des préoccupations de contamination, une plaque régulière LB peut être substitué. Peser 5,5 g XLD agar et remettre en suspension dans 5 ml d'eau déminéralisée. Bien mélanger jusqu'à ce que tous agar est humide. Ajou…

Representative Results

A 20 ° C, la durée de vie médiane de type sauvage vers N2 est de 17 jours (figure 2A et Tableau 2). L'infection à Salmonella diminue de manière significative la durée de vie médiane de vers N2 à 10,5 jours (p = 0,0002, log-rank test) (figure 2A ). Si un C. gène elegans joue un rôle important dans la défense contre l'infection à Salmonella, il est prévu que son inhibition peut …

Discussion

C. elegans est un simple organisme modèle génétique qui mange des bactéries comme source d'éléments nutritifs. Ainsi, il est aisé de substituer sa nourriture bactérienne normale avec un agent pathogène intestinal pour enquêter sur les interactions entre C. elegans et l'agent pathogène choisi. Ici, un protocole est décrit à combiner infection à Salmonella et C. elegans ARNi alimentation de traitement pour examiner le rôle des gènes de l'hôte dans la défens…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions le Dr Diane Baronas-Lowell pour la lecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par un Charles E. Schmidt College FAU des sciences Subvention de démarrage et une bourse d'études du vieillissement de la Fondation médicale Ellison à KJ

Materials

LB Broth Fisher BP9723-500
XLD agar EMD Chemicals 1.05287.0500
Bacto Agar Fisher DF0140-01-0
Peptone Fisher BP1420-500
Sodium Chloride Fisher S671-500
Calcium Chloride Fisher C69-500
Magnesium Sulfate Fisher M65-500
IPTG Gold Biotechnology 12481C50
Cholesterol Sigma C8667-25G
Ampicillin Fisher  BP1760-25
Salmonella typhimurium ATCC ATCC14028
Petri Dish 95 x 15mm Fisher FB0875714G
Petri Dish 60 x 15mm  Fisher 08-757-13A 
Falcon Serological pipet Fisher 13-668-2
Falcon Express Pipet-Aid Fisher 13-675-42
MaxQ6000 shaking incubator  Thermo Scientific SHKE6000-7
Incubator Percival I-36DL

References

  1. Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
  2. Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Genetics. 77, 71-94 (1974).
  3. Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
  4. Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
  5. Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
  6. Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
  7. Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
  8. Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
  9. Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
  10. Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
  11. Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
  12. Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
  13. Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
  14. . The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
  15. Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
  16. Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
  17. Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
  18. Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
  20. Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
  21. Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).

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Cite This Article
Zhang, J., Jia, K. A Protocol to Infect Caenorhabditis elegans with Salmonella typhimurium. J. Vis. Exp. (88), e51703, doi:10.3791/51703 (2014).

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