Het meten van antilichaam-functie is de sleutel tot het begrijpen van immuniteit tegen Plasmodium falciparum malaria. Deze methode beschrijft de zuivering van levensvatbare merozoïeten en meting van opsonisatie-afhankelijke fagocytose door flowcytometrie.
Plasmodium falciparum merozoite antigenen zijn in ontwikkeling als potentiële malariavaccins. Een aspect van immuniteit tegen malaria de verwijdering van vrije merozoïeten uit het bloed door fagocytische cellen. Echter bepaling van de functionele werkzaamheid van merozoïet specifieke opsoniserende antilichamen uitdaging vanwege de korte halfwaardetijd van merozoïeten en de variabiliteit van primaire fagocyten. Hierin in detail beschreven is een werkwijze voor het levensvatbare merozoites met de E64 proteaseremmer en een test van merozoïet opsonine-afhankelijke fagocytose met de pro-monocytische cellijn THP-1. E64 voorkomt schizont breuk terwijl de ontwikkeling van merozoïeten die vrijkomen door filtratie van de behandelde schizonten. Ethidiumbromide gemerkte merozoites worden geopsoniseerd met humaan plasma en toegevoegd aan THP-1-cellen. Fagocytose wordt beoordeeld door een gestandaardiseerd high throughput protocol. Levensvatbare merozoïeten zijn een waardevolle bron voor de beoordeling numerlende aspecten van P. falciparum biologie, met inbegrip van de beoordeling van het immuunsysteem. Antilichaam niveaus gemeten van deze assay worden geassocieerd met klinische immuniteit tegen malaria in natuurlijke blootgestelde individuen. De test kan ook van nut zijn voor de beoordeling van antistoffen op.
Het belang van antilichamen voor immuniteit tegen Plasmodium falciparum malaria werd 40 jaar geleden, toen immunoglobuline van hyperimmuun volwassenen werd passief overgedragen aan kinderen met ernstige malaria resulteert in verminderd ziekte 1 getoond. Derhalve is aanzienlijke inspanning getracht doelstellingen van beschermende immuniteit malaria identificeren, meestal door meten antistoftiters tegen peptiden of bacterieel tot expressie gebrachte eiwitten door ELISA. ELISA gebaseerd serologie heeft ook bewezen zeer variabel tussen studies, en niet antilichaam functionaliteit 2 pakken. Veel malaria antigenen induceren een cytofiele IgG1 en IgG3 antilichaam profiel, met name merozoieten oppervlakte-antigenen 3. Deze subklasse vooroordeel suggereert dat antilichaam-Fc-receptor (FcR) interacties met fagocyten zijn belangrijk voor de effectorfuncties van opsoniserende antilichamen antimerozoite 4. Verschillende merozoite antigeen vaccins in ontwikkeling zijn ontworpenontlokken fagocytensysteem effector functies 5, 6 en hoewel significant bewijs voor het belang van antilichaam-FcR interacties in modellen van knaagdieren malaria bestaat 7-9, en een paar recente studies ondersteunen het belang van functionele antilichamen en fagocytensysteem effector functies immuniteit voor malaria bij de mens 10, 11, dit gebied nog onvoldoende bestudeerd. Onderzoek naar merozoite specifieke opsoniserende antilichamen is beperkt door twee factoren; de moeilijkheid om goede kwaliteit merozoïeten; en variabele fagocytose reacties van primaire cellen.
Tot voor kort werden hoge snelheid centrifugeren of Percoll dichtheidsgradiënten gebruikt om merozoïeten isoleren van kweeksupernatanten van scheuren schizont culturen. Deze merozoïeten waren zelden haalbaar, en vaak verder gemanipuleerd door dichtheidscentrifugatie en meerdere wassen stappen 12, of cryopreservatie 11 voor gebruik in testen. Deze processes potentieel los vele perifeer geassocieerde eiwitten uit de merozoieten oppervlak Proteïnen, die antigene doelen van malaria-immuniteit 13 zijn. Onlangs is gebruikt de cysteine proteaseremmer trans-Epoxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butaan (E64) aan gezonde merozoites genereren. E64 voorkomt schizont breuk genereren membraan ingesloten merozoites 14, die kan worden verstoord door filtratie levensvatbare merozoites 15, 16 bevrijden. Deze techniek heeft geleid tot de ruimtelijke resolutie van talrijke eiwitten in erytrocyten invasie 15, 17-19 en heeft het stadium specifieke werking van verschillende antimalariamiddelen 16, 20 verduidelijkt. De generatie van levensvatbare merozoites blijft technisch uitdagend. Om te helpen bij de verspreiding van deze techniek en toepassing op functionele testen van de immuniteit, een gedetailleerd protocol voor levensvatbare merozoite zuivering en het gebruik ervan in eengestandaardiseerde functionele test van antilichaam: cellulaire samenwerking in opsonisatie en fagocytose wordt hier beschreven.
Deze techniek laat een significante verbetering ten opzichte van eerdere in vitro testen van merozoite opsonisatie, zoals neutrofielen ademhalingsuitbarsting, Antibody Dependent Cellular Remming (ADCI), en alternatieve merozoite fagocytose assays. Deze testen zijn slecht reproduceerbaar door variatie in parasiet ingangen en de activiteit van primaire fagocytische cellen 11, 21. Verontreinigende hemozoin kan ook een diepgaand effect fagocytensysteem functie 22. Een onlangs gemeld robuuste en reproduceerbare merozoite fagocytose assay 23 maakt gebruik van de promonocytische cellijn THP-1 24. Dit is een ideale celtype voor hoge doorvoer flowcytometrie testen zoals het niet-hechtend en specifiek voert Fc-receptor bemiddelde fagocytose 25, 26. Een extra complexiteit, terwijl investeerderstigating fagocytose is dat de mate van fagocytose is afhankelijk van het aantal merozoites opzichte van THP-1-cellen en plasmaconcentratie. Om reproduceerbaarheid tussen experimenten te waarborgen, moet merozoites worden opgesomd en een gedefinieerde concentratie gebruikt. Door hun kleine formaat, stroomcytometrische kwantificering is vereist.
De hier beschreven procedure verwijdert hemozoin en genereert levensvatbare merozoïeten, en beschrijft een toepassing van deze merozoïeten voor flowcytometrische telling van merozoïeten gevolgd door opsonisatie en fagocytose. Hoewel technisch veeleisende, kan de beschreven technieken handig zijn bij het ophelderen van de bijdrage van merozoite oppervlak specifiek antilichaam reacties op natuurlijk verworven en vaccin-geïnduceerde immuniteit.
Om merozoite fagocytose te meten, wordt vaardigheid in twee technieken die nodig zijn: zuivering van merozoïeten en THP-1 fagocytose assay. De meest kritische stappen voor het combineren van deze twee technieken zijn: 1) Highly gesynchroniseerd parasieten; 2) toevoegen van E64 op het juiste moment membraan omsloten merozoites verkregen; 3) Het verwijderen hemozoin om aggregaten te voorkomen; 4) Nauwkeurige merozoite tellen door flow cytometrie; 5) de verdunning van plasma gebruikt; en 6) behoud van een lage celdichtheid en passage aantal THP-1-cellen. Zorgvuldige afweging van deze belangrijke aspecten zal zorgen robuuste fagocytose reacties worden waargenomen.
Hoewel beschreven is de bereiding van merozoïeten ter beoordeling fagocytose, kan de techniek worden gebruikt voor uiteenlopende toepassingen. Ongeacht de stroom methodologie, optimale merozoite voorbereidingen afhangen van de juiste timing E64 aanvulling om merozoïeten genereren. De E64 hier beschreven methode is aangetoond dat yield invasieve merozoïeten voor gebruik in hoge resolutie microscopie van invasie evenementen en drug gevoeligheid testen 15-20. Terwijl merozoite levensvatbaarheid niet essentieel is voor fagocytose, wordt de integriteit van de merozoite toplaag nodig. Daarom is de E64 hier beschreven methode maakt hoge kwaliteit merozoites moeten worden geproduceerd voor de beoordeling antilichaamreacties tegen de oppervlaktelaag. Zoals in figuur 1, als E64 te vroeg of te laat toegevoegd membraan ingesloten merozoites niet gevormd. Daarom zijn zeer synchrone parasiet culturen nodig. Hier, het gebruik van sorbitol en heparine behandelingen strak synchroniseren D10-GFP parasiet culturen een venster van 2 uur wordt beschreven. Heparine kan bevorderen gametocytogenesis andere laboratorium isolaten, en dus moet zorgvuldig worden gebruikt. Alternatieve synchronisatiemethode zoals alanine kunnen ook worden gebruikt, mits goed gesynchroniseerd parasieten geproduceerd 29. Als E64 wordt toegevoegd aan asynchrone parasieten, een lagere proportion van membraan-omsloten merozoïeten zal worden geproduceerd en de resterende parasieten geïnfecteerde RBC zal ofwel scheuren normaal of afwijkingen ontwikkelen morfologie. De aanwezigheid van parasieten die niet hebben ontwikkeld tot membraan-omsloten merozoites leidt tot verstopping van het filter en aanzienlijke vermindering van de merozoïet opbrengst verkregen.
Tijdens filtratie van membraan-omsloten merozoïeten, hemozoin is bevrijd van de spijsvertering vacuolen en aanwezig als vrije kristallen in oplossing is. Hemozoine zeer proinflammatoire en gerapporteerd aan monocyt en macrofaag fagocytose antwoorden 30, 31 moduleren. Naast moduleren fagocytose, zoals getoond in figuur 2, hemozoin kunnen aggregaten met merozoites in oplossing. Zoals THP-1-cellen deze aggregaten kunnen fagocyteren, kan dit een belangrijke confounder voor de oplossing van antilichaam-gemedieerde fagocytose zijn. Daarom is verwijderen van hemozoin noodzakelijk in deze assay avoid extra complexiteit van hemozoin op fagocytensysteem biologie. Bovendien kan het niet hemozoin verwijderen ook schadelijk zijn bij gebruik van deze techniek om vrije merozoïeten voor andere toepassingen genereren, vooral wanneer merozoite kwantificering vereist.
Zoals in figuur 4, het aantal merozoites toegevoegd aan de test kan de mate van fagocytose beïnvloeden door THP-1-cellen. Hoewel flowcytometrie maakt voor de telling van merozoite concentratie, voorzichtig pipetteren en repliceren tellingen van merozoïeten noodzakelijk om de nauwkeurigheid te verbeteren. Dit is vooral van belang indien verschillende parasiet lijnen worden getest side-by-side. Eerder is aangetoond dat plasma uit semi-immune kinderen van PNG aanzienlijk kan worden verdund reacties dalen 23. Hier beschreven is de optimale verdunning van plasma (1/120, 000 uiteindelijke verdunning van plasma) voor een cohort van 5-12 jaar oude PNG kinderen dat het grote aanbod van phagocyt geproduceerd. osis reacties in figuur 5 beschreven Dit moet voor een stratificatie van de reacties in vier groepen (0-19%, 20-39%, 40-59% en 60-79% fagocytose) en regressie modellering bleek dat opsoniserende reacties werden geassocieerd met bescherming tegen klinische ziekte en high-density parasitemie 10 Voor verschillende cohort-studies noodzakelijk kan plasma verdunning passen aan de fagocytose waarborgen door THP-1 cellen wordt niet of onder het detectieniveau verzadigd.
Flowcytometrie maakt een snelle en meetbare fagocytose met verbeterde nauwkeurigheid over microscopie. Dit protocol is een hoge doorvoer, schaaltje gebaseerde en geautomatiseerde verkrijging van 96 well platen met natuurlijk verworven humorale immuniteit bestuderen. De werkwijze vereist kleuring van merozoïeten met ethidiumbromide echter alternatieve DNA vlekken zoals SYBRGreen, DAPI en propidiumjodide, membraan vlekken of eiwit vlekken kunnen worden gebruikt. Deze test zou vatbaar zijn Primary monocyten of neutrofielen, en kan worden aangepast indien fagocytensysteem of FcR biologie van belang was. Primaire cellen of THP-1 cellen gedifferentieerd in vitro met PMA kunnen worden gebruikt om fagocytose studeren malaria en andere pathogenen 12, 32-34. Echter gebruik van primaire cellen uitdagend omdat deze cellen hechtend en ook worden weergegeven niet-antilichaam-gemedieerde fagocytose 35. Bovendien variabiliteit in reinheid, levensvatbaarheid en functionaliteit zijn enkele belangrijke beperkingen aan het gebruik van primaire fagocyten. De Fc-receptoren betrokken bij merozoite fagocytose blijven gekarakteriseerde en derhalve met blokkerende antilichamen tegen specifieke Fc receptoren zou de bijdrage van elke Fc Receptor fagocytose merozoïet helderen. Zoals THP-1 fagocytose is FcR afhankelijk, dit maakt eenvoudige interpretatie van de fagocytose waargenomen. Deze test leent zich ook voor het aanpakken van de antigeenspecificiteit van opsoniserende antilichamen die kan worden bereikt door utilizing knock-out parasieten voor merozoieten oppervlakte-antigenen, of met behulp van affiniteit gezuiverde humane antilichamen tegen oppervlakte-eiwitten merozoite. Bovendien diepgaande studies van cytokine responsen na merozoite fagocytose ontbreken, en kan worden bereikt met deze test.
Deze twee technieken vormen aanzienlijke vooruitgang bij het onderzoek van functionele antimerozoite antilichamen. De zuivering van hoge kwaliteit merozoites voordelig om gebruik gecryopreserveerd merozoites, of fluorescerende microbolletjes bekleed met merozoite antigenen. Hoewel deze test is gebruikt als een instrument voor het evalueren natuurlijk verworven immuniteit kan blijken een belangrijk hulpmiddel om de verwerving van immuniteit in reactie op vaccinatie. Hoewel het is onlangs aangetoond dat de fagocytose of opsonised merozoites is geassocieerd met bescherming tegen klinische malaria, is het niet mogelijk om direct conclusies uit in vitro THP-1 fagocytose in vivo phagocytosis van merozoïeten fagocytose in deze test vindt plaats onder statische omstandigheden en bij afwezigheid van concurrerende rode bloedcellen. De mogelijke aanpassingen van deze test kan dus een veelzijdig hulpmiddel voor een beter begrip van malaria en merozoite fagocytose.
The authors have nothing to disclose.
De auteurs willen de kinderen en volwassen plasmadonoren, en het personeel van de Papoea-Nieuw-Guinea Institute of Medical Research erkennen. De auteurs willen graag Amandine B Carmagnac, Catherine Q Nie, Danny W Wilson, Ivo Mueller en Diana S Hansen bedanken voor hun bijdrage aan de ontwikkeling van deze techniek, en dank het Australische Rode Kruis voor bloed en serum packs. Dit werk werd mogelijk gemaakt door de Victoriaanse Overheid van de Staat Operationele Infrastructuur Ondersteuning en Australische regering NHMRC IRIISS. Dit werk werd ondersteund door de National Health en Medical Research Council verleent # 1031212 en # 637406, en de National Institutes of Health subsidie # AI089686.
THP-1 cell line | American Type Culture Collection | TIB-202 | |
RPMI-1640 | Gibco | 31800-089 | |
Fetal Calf Serum (FCS) | Invitrogen | 10099-141 | |
2-mercapthoethanol | Sigma-Aldrich | M6250-100ML | Use in Fume Hood |
Pen/Strep Solution (100x) | Sigma | P0781 | |
HEPES | SAFC | 90909C | Cell culture grade |
hypoxanthine | Calbiochem | 4010 | |
Human Serum | Donation from Autralian Red Cross | Available commercially (i.e. Invitrogen) | |
sodium bicarbonate (NaHCO3) | Merck | 1.06329.0500 | |
gentamycin | Pfizer | 61022027 | Injection Quality |
heparin Sodium BP (5000IU/mL) | Pfizer | procine origin | |
Blasticidin S-hydrochloride | Sigma-Aldrich | 15205 | |
D-sorbitol | Sigma-Aldrich | 50-70-4 | |
E64 Protease Inhibitor | Sigma-Aldrich | E3132-10MG | |
KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 98281-100G | Use for phosphate buffer |
Na2HPO4.2H20 | Merck | 10383.4G | Use for phosphate buffer |
Giemsa's azur eosin methylene blue solution | Merck | 1.09204.0500 | 1:10 dilution in 6.7mN Phosphate buffer (make fresh each stain) |
EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
Acrodisc Syringe Filters 1.2-μm/32-mm | Pall Life Sciences | 4656 | |
QuadroMACS Separator (for small column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-091-051 | Interchangeable with MidiMACS |
VarioMACS Separator (for large columns) | MACS Miltenyi BioTec | 130-090-282 | |
MACS MultiStand | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-303 | |
LS Column (small magnetic column) | MACS Miltenyi BioTec | 130-042-401 | |
large magnetic column | MACS Miltenyi BioTec | 130-041-305 | |
Ethidium Bromide | Bio-Rad | 1510433 | Cytotoxic |
CountBright Absolute Counting Beads | Invitogen | C36950 | |
BD FACSCalibur Flow Cytometer with HTS plate reader | BD Biopsciences | ||
EDTA disodium salt | Merck | 10093.5V | 0.1M, pH 7.2 |
FlowJo cytometry analysis software | Tree Star |