高収率の精製<em>熱帯熱マラリア原虫</emオプソニン抗体アッセイにおける使用のための>メロゾイト

注：すべてのステップは、遠心分離およびフローサイトメトリーに加えて、無菌性を維持するために、層流フード内で行われるべきである。適切な予防措置がヒトのサンプルの取り扱いに関する取られることを確認してください。アッセイは、血漿の少量のために非常に敏感である。パプアニューギニア（PNG）から半免疫子供からプラズマで78％ – 提供希釈を5に至るまでの応答を解決するために最適である。最適な希釈は、プラズマセットがテストされていると異なる場合がありますので、それがプラズマは、各アプリケーションのための実験条件を決定するために調べられることをお奨めします。 2陰性コントロール血漿の非存在下でのメロゾイトを用いたTHP-1細胞の混入を確認してください。およびメロゾイトを用いたTHP-1細胞は、マラリアナイーブ個体からの血漿のプールでオプソニン化。これは、THP-1細胞へのメロゾイトの遵守のための制御を可能にし、食作用のイベントの厳密なフローサイトメトリーティングを可能にする。 PNG血漿試料を用いた医学研究諮問委員会、パプアニューギニア保健省、ウォルターとエリザホール研究所ヒューマン研究倫理委員会（プロジェクト番号4月4日）で承認されました。書面による同意は、すべての参加者の両親/保護者から得られた。 1。THP-1培養 5％CO 2加湿インキュベーター中、10％ウシ胎児血清（FCS）、55μM2 – mercapthoethanol（THP-1培地）を補充したRPMI-1640培地中で37℃でのヒト単球細胞株THP-1を維持する。 5×10 5細胞/ ml以下の濃度で細胞を維持する。注：過成長付着細胞へとダウンレギュレーションのFc受容体の分化になります。細胞が約10回継代された後、細胞表現型を維持するために新しいバイアルを解凍。 2。抗体サンプル調製と希釈 56℃でインキュベートすることによってテストされ、マラリアナイーブ管理血漿ことへの熱不活性化プラズマ; 30分間C 直列THP-1培地中で1/2、000に、血漿試料を希釈する。 -20℃で保存希釈した血漿高度同期Pの3。文化熱帯マラリア 注：GFP発現寄生虫ラインD10-PfPHG 27が原因寄生虫の同期とE64添加の制御されたタイミングをアシストする、その48時間のライフサイクルに利用された。この行は、細胞質ゾル中のGFPを発現しているためさらに、この行は、GFPのフローサイトメトリー検出によって寄生虫で無料のメロゾイトの検出を可能にする。しかし、GFPの蛍光強度がTHP-1細胞内で視覚化を提供するのに十分ではないため、メロゾイトはエチジウムブロマイド（EtBrを）で対比されている。他の寄生虫株は、タイトな同期が達成可能であることを条件として、利用することができる。侵入15を阻害するために成熟型28とヘパリンを溶解し、ソルビトール、治療の組み合わせを使用して、寄生虫を同期させる</sアップ>。 Pを維持25 mg / mlのHEPES、50μg/ mlのヒポキサンチン、10％プールヒト血清、2 mg / mlの重炭酸ナトリウムを補充したRPMI-1640培地（pH7.4）中3％のヘマトクリットにおけるO +ヒト赤血球（RBC）中の熱帯熱マラリア原虫 、および20μg/ mlのゲンタマイシン（寄生虫培地）。 GFP +寄生虫を選択するために培養液に5 mg / mlのブラストサイジンS塩酸塩を追加します。 1％O 2、4％CO 2及び95％N 2の雰囲気下で37℃で気密ボックスまたは代替的に密封された二重培養フラスコ中で培養物をインキュベートする。 寄生虫血をモニターするために10分間リン酸緩衝液（ギムザ溶液）6.7 mMの液（pH7.1）中で調製し、薄い塗抹スライドを、10秒間100％メタノールで固定し、10％ギムザ液で染色する。染色後、水と空気乾燥でスライドをすすぐ。 100倍油浸レンズを用いて寄生虫を評価する。 文化を分割し、感染していない追加することにより、5パーセント感染RBC以下の寄生虫の寄生虫の文化を維持する必要に応じて、RBC。 ヘパリンと同期するように、リング段階の培養に医療グレードのヘパリン20 IU / mLを加え。 寄生虫の大半は分裂の段階にある場合には、5分間300×gでペレット細胞は、分裂の破裂およびメロゾイト侵入を可能にするために寄生虫の培地中のヘパリン含有培地で再懸濁を削除します。 4時間後、それ以上のメロゾイト侵入をブロックし、バックの文化に20 IU / mlのヘパリンを追加します。 NOTE：寄生虫が十分に同期される前に、ソルビトールおよびヘパリン治療のいくつかのサイクルが必要とされ得る。 5％の寄生虫 – メロゾイトの適切な数を生成するには、3から寄生虫の文化の150ミリリットルを用意。 後期Pの4。分離熱帯熱マラリア栄養型三十六時間の培養液にヘパリンを戻した後、5分間300×gで培養した細胞をペレット化し、25％のヘマトクリットで寄生虫培地中でペレットを再懸濁。 大型磁気カラム（6.3のマトリックス容積を添付ml）を磁石にし、全ての気泡が除去されることを確認しながら、寄生虫媒体でカラムを平衡化させます。 再懸 ​​濁Pを追加熱帯熱マラリアの列に文化、毎秒1滴に流量を調整します。 文化がカラムを通過した後、フロースルーが明確実行されるまで、寄生虫媒体でカラムを洗浄。 37℃の寄生虫培地30ミリリットルの列から寄生虫を溶出する。 、寄生虫の薄汚れを準備し10秒間100％メタノールで固定し、3分間のギムザ液で染色。顕微鏡下でスライドを調べ、寄生虫はほとんどの赤血球を埋めていることを確認し、初期の分裂段階にあるように見える。寄生虫は、適切な成熟段階に達していない場合は、適切に開発されるまで、1％O 2、4％CO 2及び95％N 2の雰囲気下、37℃のインキュベーターに精製された寄生虫を返す。 NOTE：90％以上の感染した赤血球の純度はRを確実にするために必要とされるBCSがメロゾイト準備を汚染しない。 。10μMのE64 6（エポキシスクシニル-L-leucylamido（4 – グアニジノ）ブタン（E64）で孤立シゾントを扱う – 10時間注：E64とのより長いインキュベーション時間が可能であり、しかし、生産メロゾイトはもはや侵襲的なことはありません。 Pの5。分離熱帯熱マラリア原虫メロゾイト E64とのインキュベーション後、100％メタノールで細胞を固定し、膜に囲まれたメロゾイトの形成を評価するためのギムザ溶液で染色、寄生虫を汚す。注：寄生虫の50％より多くが膜囲まメロゾイトを形成している場合は、メロゾイトの良好な収率が得られる。 8分間1900×gでペレットE64処理シゾント。残りのヒト血清を除去するために25 mg / mlのHEPES、50μg/ mlのヒポキサン​​チン、2 mg / mlの重炭酸ナトリウム、および20μg/ mlのゲンタマイシン（洗浄媒質）を補充したRT RPMI-1640培地（pH7.4）を50mlで洗浄する。 洗浄培地2mlにペレットを再懸濁。注：FCS含有THP-1メディアは濾過中に泡立ちが生成されます使用する。 再懸濁したE64-シゾント2mlの1.2μm/32ミリメートルシリンジフィルターでろ過する。 10ミリリットルチューブにろ液を集める。注：ろ液をフィルターに集め、未破裂シゾントや破片で、メロゾイトおよびヘモゾイン結晶が含まれています。 磁石に小さな磁気カラムを取り付け、500μlのTHP-1培地で平衡化させます。 磁気カラムにろ液を渡します。フロースルーを収集します。注：メロゾイトは通過するヘモゾインは、カラムに結合します。 毎回通る流れを集め、ヘモゾインを除去してカラムに2回以上、フロースルーを渡す。 残りのメロゾイトを収集するために、RT、THP-1培地2mlでカラムを洗浄します。 10μg/ mlの（最終濃度）で処理し、室温で30分間染色でのEtBrを追加します。光退色を防止するために、光から保護してください。注：すべてのEtBrを汚染ていることを確認した液体とpラスチック廃棄物は、細胞毒性化学物質に適した方法で処分される。メロゾイトは、このインキュベーション後に、もはや侵襲的ではありません。 10分間4000×gでメロゾイトをスピンダウン。 適切な廃棄容器に上清を捨てる。 4ミリリットルTHP-1培地でメロゾイトペレットを再懸濁し、10分間4000×gでスピンダウン。 15ミリリットルの容量にしたTHP-1培地を追加し、光から保護します。 フローサイトメトリーによる6。定量化メロゾイト濃度 RTにカウントビーズを持参してください。 メロゾイトを希釈するため、0.5％BSAを含むPBSを準備します。 3希釈でメロゾイトを数える。 100中1; 50と25での1の1はそれぞれ、PBS +0.5％BSAを940、930および910μlの3 FACSチューブを準備します。それぞれ、チューブあたり精製されたメロゾイトの10、20および40を添加する。 渦は30秒間ビーズをカウントし、希釈されたメロゾイトを含むFACSチューブあたりのビーズの50μlを加える。 3 DILを実行488nmレーザーを備えたフローサイトメーターでサンプルをメロゾイトuted。 EtBrをおよびGFP蛍光のデュアル蛍光に基づいてメロゾイトの厳しいゲートを設定し、ゲートが別々のチャンネルで蛍光によってビーズを数える。 2000ビーズが収集されるまでのイベントを取得する。注：これらの命令は、EtBrで対比染色されたカウントのGFP +メロゾイトを参照してください。寄生虫GFP発現を利用しない場合には、側方散乱とのEtBrの蛍光に基づいてメロゾイトゲートを設定します。 2000カウントのビーズイベントによってメロゾイトイベントの数で除してビーズ、各希釈用の比率を計算します。メロゾイトの比率を決定する。チューブ毎に添加ビーズ50μlのビーズの数を決定するために、計数ビーズバッチの仕様を使用してください。 希釈係数をとメロゾイトで50μlのビーズの数を掛ける：その希釈倍率のためのビーズの比率を。この数は、1mlあたりメロゾイトの濃度に相当します。目を実行する各希釈するためのステップをESE。 3希釈液の両端で測定メロゾイト濃度を平均する。 50で100、1で1のために測定された濃度が10％を超える標準偏差を、そして1 25内の希釈液を、カウントのサンプルを作成する際に、技術的に不適切な記述を示します。注意して​​ください。 THP-1細胞あたり4メロゾイトの最終比を確保するために、THP-1培地中に8×10 6メロゾイト/ mlで再懸濁メロゾイト。 NOTE：THP-1比率に対する他のメロゾイトを使用してもよく、および濃度に応じて修正すべきである。 7。食作用アッセイ 96ウェルU底プレートのウェルあたりの熱非アクティブのFCS 200μl加え、プレートをブロックするために、RT、O / Nで去る。インキュベーションに続いて、FCSを削除し、200μlの滅菌PBSで2回、ウェルを洗う。必要になるまで4℃で、PBSと店舗プレートを取り外します。 1×10で試料あたり三連のウェルを可能にする、血漿サンプルおよびコントロールをテストするために必要なTHP​​-1細胞の数を計算する<suP> 5 THP-1細胞ウェルあたり。 血球計スライド上に文化の10μlをロードすることによって、THP-1培養濃度を測定。顕微鏡下で血球計の16の角の正方形の4組の中に存在する細胞の数をカウントし、カウントを平均する。ミリリットル当たりの細胞の数を計算するために万で平均回数を掛けます。 5分間500×gでTHP-1細胞の必要数をスピンダウンし、そしてTHP-1培地中の6.7×10 5細胞/ mlで再懸濁する。 10 5細胞/ウェルで、その結果、FCSでブロックされた96ウェルU底プレートにウェル当たりのTHP-1培地中のTHP-1細胞を150μlを加える。テストされる試料あたり3ウェルを準備します。メロゾイトを追加する準備ができるまで、インキュベーターにプレートを返します。 よく別々のFCSでブロックされた96ウェルU底プレートに8×10 6 / ml当たりのメロゾイト準備150μlのを追加します。テストサンプルあたり1をよく準備する tに、ウェルごとに調製した希釈血漿サンプルを10μlを追加彼はメロゾイトが含まれているプレートと、均一な溶液を確保するために、よく混ぜる。 インキュベーターからのTHP-1プレートを取り外し、よく血漿サンプルあたり三連ウェルで、THP-1細胞を含むあたりのメロゾイト/血漿溶液50μlを加える。 よく混ぜて、5％CO 2、40分間加湿インキュベーター中、37℃でインキュベートする。光から保護するためにホイルでカバーしています。 40分後、4℃、500×gで5分間遠心分離サンプルが食作用を逮捕する遠心機を予備冷却。 上清を除去し、氷冷PBS +0.5％BSA 2のEDTA（FACS緩衝液）中で細胞を2回洗浄します。 NOTE：EDTA、フローサイトメトリー分析のための単一細胞懸濁液を維持するのが容易になる。 PBS中の2％パラホルムアルデヒド（PFA）+0.5％BSA 2のEDTA（FACS固定液）の90μLで細胞を固定します。光から保護して取得、まで氷上のままにしておきます。 8。フローサイトメトリー装備WIフローサイトメーターを用いて、サンプルを取得する488nmレーザー、高スループットプレートリーダーアタッチメントを番目。注：これは1メロゾイトの準備からテストされる400血漿サンプルまで可能になります。細胞はまた、マニュアルサンプルローディング用のチューブに転送することができます。 前方および側方散乱によるゲート可能なTHP-1細胞。 コントロールのメロゾイトなしプラズマを用いたTHP-1細胞のに基づいてEtBrを正のゲートを設定します。 サンプルあたり10,000事象の最小値を取得する。 9。データ解析解析ソフトにフローサイトメトリーを使用してデータを分析し、EtBrを正のイベントのために厳格なゲートを設定します。 非免疫血漿を試料マイナス％陽性細胞についてのEtBr +細胞の％：各サンプルのパーセント食作用を計算します。 三重全体の平均の結果。注：10％を超える三連の標準偏差は、実験的な不正確さを示している。いくつかの背景のEtBr陽性事象はmerozoiの結果として観察されることがあるTE THP-1細胞の表面への付着が、メロゾイトを含むすべてのサンプル間で一貫している必要があります。 「メロゾイトを用いたTHP-1細胞および無血漿 '制御に基づいてゲートを設定し、[コントロール'非免疫血漿を用いたTHP-1細胞のいずれかのバックグラウンドを差し引くことにより、内部化する蛍光を反射％の貪食になります/のみメロゾイトを貪食。