High Throughput Screening Expression quantitative et purification appliquée à recombinant disulfure riches protéines venin produit dans<em> E. coli</em

Partie A: Transformation et expression de test Procédures manuelles pour le clonage 22 et la transformation de purification sont discutés ailleurs 24. Le protocole de transformation peut être effectuée entièrement sur ​​le robot 26, mais il est généralement plus efficace le temps de le faire manuellement. Par conséquent, les protocoles ici commencent à partir de l'inoculation des pré-cultures d'expression et placage de la transformation de la transformation choqué de chaleur mélange fait manuellement. Pour plus de détails sur les procédures manuelles de clonage et de transformation voir les références pertinentes 22,24. 1. Précultures et placage Préparer la table de travail du robot (voir la figure 4 pour les postes): Mettre une auge 300 ml contenant 150 ml de bouillon LB stérile (supplémenté avec de l'ampicilline (100 ug / ml) / Chloramphenicol (34 ug / ml), ou d'un autre antibiotique approprié) à la position 8. Mettez un DW stérile96 à la position 11. Mettez pré-établi à 24 puits LB agar 4x (Amp / Cam) des plaques de culture tissulaire (contenant 2 ml de gélose dans chaque puits) avec leurs couvercles sur des positions 14 à 17. Mettez la plaque de transformation (contenant la transformation 96 mélange après choc thermique) à la position 13. Ceci sera utilisé pour inoculer les pré-cultures liquides et des plaques de gélose LB. Mettez une boîte de pointes de pipette 200 ul stériles à la position 18. Utilisation du bras 96 multicanal (MCA96) et 200 conseils de pi, aspirer 200 pi de bouillon LB (position 8), et distribuer dans le DW96 à la position 11. Répétez jusqu'à ce que il ya un volume final de 1 ml de bouillon LB dans chaque puits de la DW96. Cela va devenir la préculture liquide. Utilisation du robot manipulateur (Roma), retirer le couvercle de la première de 24 puits plaque de gélose LB et placer ailleurs (par exemple dans un véhicule de l'hôtel) jusqu'à ce que le placage est terminé pour cette plaque. Utilisation de la manutention (LihA) tête liquide à 8 canaux, mélanger puis aspirer 50 pi de til la première colonne de mélange de transformation à la position 13. Ce volume de mélange de transformation est juste assez pour bien couvrir le LB-Agar. Avec les quatre premiers canaux, distribuer sur la première colonne de la première plaque de 24 puits de gélose LB en position 14 (comme représenté sur la figure 5). Avec les quatre derniers canaux, passer sur la deuxième colonne de la première plaque de 24 puits de gélose LB. Lavez tous les conseils soigneusement après la distribution. Continuez ce processus jusqu'à ce que toutes les transformations ont été plaqué sur la première plaque à la position 14, le transfert de 96 – à 24 puits en utilisant le schéma présenté à la figure 5. Une fois la première plaque a été terminé, utilisez les Roms pour remplacer le couvercle et retirez le couvercle de la plaque suivante à la position 15. Continuer à utiliser le système de dépôt pour les trois prochaines plaques. Une fois le placage est terminé, réglez le Te-Shake à 1200 rpm et agiter toutes les plaques pendant 1 min pour avoir une répartition homogène du mélange de transformation. </li> Utilisation de la MCA96 et les embouts de pipette originaux, mélanger puis aspirer 60 pi de mélange de transformation restant (position 13) et distribuer dans le DW96 contenant du bouillon LB à la position 11. Sceller les pré-cultures DW96 avec un film adhésif respirant pour permettre l'aération de la culture. Placer dans un incubateur à 37 ° C sous agitation à vitesse maximale O / N (200/800 tours par minute selon agitation). Les plaques d'agar LB doivent être placés dans une hotte avec leurs couvercles off à sec (10 min). Ensuite, ils sont placés à l'envers dans un 37 ° C incubateur plaque jusqu'à ce que le lendemain matin. Le jour suivant, la préculture est utilisée pour ensemencer l'expression de test dans du milieu d'auto-induction et pour la préparation de solutions mères de glycerol. Mettez les plaques d'agar dans un réfrigérateur, comme un retour. En cas de besoin, à partir des plaques d'agar ou les stocks de glycérol, l'expression de test pourrait être refaite en inoculant une préculture LB frais directement. 2. Préparation de DW24 ZYP-5052 Plaques NOTE: Cette procédure prend environ 5 minutes à remplir pour chaque jeu de plaques 4x DW24. Maquillage 500 ml ZYP-5052 moyenne auto-induction pour chaque répétition de 96 cultures (moyennes 464 ml ZY, 250 pi 2 M MgSO 4, 10 ml 50x 5052, 25 ml 20x NPS, dans cet ordre – les recettes pour chaque composant sont fourni dans le Tableau 1) complété avec les antibiotiques appropriés. Préparer la table de travail du robot: Mettez deux 300 ml creux, contenant chacune ~ 250 ml de milieu à la position 5 et 6. Mettez quatre plaques DW24 stériles à des positions 14 à 17. Mettez 200 conseils de pi à la position 18. Utilisation de la MCA96 et 200 conseils de pi, aspirer 200 pi de ZYP-5052 à partir de la position 5 et distribuer dans la première plaque de DW24 à la position 14. Pour ce faire, un total de 5 fois (4 Conseils distribuera dans un seul puits à la fois pour un total de 4 ml). Répétez l'opération pour les 3 plaques x DW24 restants à des positions 15 à 17, Switching à la ZYP-5052 à la position 6 pour les deux dernières DW24 plaques. 3. Inoculation et la croissance des cultures d'expression de test NOTE: L'inoculation prend environ 10 min à remplir pour chaque jeu de plaques 4x DW24, et la croissance continue O / N. Préparer la table de travail du robot: Mettez la plaque de DW96 contenant les pré-cultures (de l'étape 1.15) en position 11. Mettez les quatre DW24 plaques contenant du milieu ZYP-5052 (de l'étape 2.3) à des positions 14 à 17. Utilisation de l'aspiration LihA 100 pi de préculture de la position 11 à inoculer les cultures d'expression de test (1/40 de dilution) en utilisant le schéma présenté à la figure 5. Lavez la tête LihA à fond à la station de lavage entre chaque colonne des pré-cultures de 96 puits. Sceller les plaques avec DW24 film respirant et incuber à 37 ° C sous agitation (200/400 rpm) pendant 4 heures. C'est le moment de la phase de croissance au cours de laquelle glucose du milieu sera préférentiellement épuisé 27. Réduire la température à 17 ° C. Après 4 h et épuisement du glucose, le lactose va commencer à être métabolisés, ce qui conduit à l'induction de l'expression, en fournissant des conditions de croissance optimales pour BL21 (DE3) pLysS ou 2 Rosetta (DE3) pLysS, dans ce travail 22. Laisser les cellules à exprimer O / N. Utilisez la préculture restant à faire des stocks de glycérol. 4. Préparation des stocks de glycérol REMARQUE: les stocks de glycérol devraient être faits en triple pour être stockées dans différents endroits en cas de panne de congélateur. Préparer la table de travail du robot: Mettre des plaques de microtitration à la position 5 à 7 pour loger les stocks de glycerol. Mettez 300 ml bac rempli avec 50 ml de 100% de glycérol en position 8. Mettez un DW96 contenant 800 pi de préculture (après l'étape 3.2) dans chaque puits à la position 11. Mettez 200 conseils de pi à la position 18. L'utilisation d'un sloaspiration et la distribution de vitesse w, utilisez le MCA96 et 200 conseils de pi pour ajouter du glycérol dans le DW96 contenant les pré-cultures. Aspirer 200 ul de glycerol (à partir de la position 8). Distribuer 150 pl (en position 11), puis une pause de 20 secondes pour permettre à la glycérine restante pour atteindre la partie inférieure de la pointe. Répartir les 50 pi restants. En utilisant les mêmes conseils, mélanger la culture et de la glycérine dans la DW96 à la position 11 jusqu'à ce qu'ils soient bien mélangés. La concentration finale de glycérol est de 20%. Aspirer 140 ul de la DW96 et distribuer dans la première plaque de microtitration en position 5. Répéter l'étape 4.3 pour chaque plaque de microtitration restante (positions 6 et 7). Sceller chaque microplaque avec du ruban adhésif en plastique et conserver à -80 ° C. Jeter la culture restant dans le DW96, décontamination avec un agent antimicrobien avant élimination. 5. L'évaluation de la croissance des cultures <p class = "jove_content"> NOTE: Il n'est généralement pas nécessaire d'évaluer le taux de croissance final la DO finale 600 est généralement le même pour la plupart des cultures (environ 12 dans ces conditions), mais des cultures qui ne poussent pas à noter. Prenez 50 pi de chaque culture (de l'étape 3.4) et distribuer dans une plaque de microtitration clair à fond plat contenant 150 pi de milieu. Mesurer la DO 600, en tenant compte de la dilution d'un facteur 4. S'il y en a qui n'ont pas grandi très bien, notez ce pour l'analyse finale. 6. Récolte des cellules NOTE: Cette procédure prend environ 45 minutes à compléter. Centrifuger les plaques 4x DW24 (de l'étape 3.4) à 3000 g pendant 10 min, puis jeter le surnageant dans un conteneur de déchets contenant un agent antimicrobien. Appuyez sur les plaques, à l'envers, sur du papier absorbant pour éliminer tout excès du milieu. Entre-temps, préparer 100 ml de lyseun tampon (50 mM de Tris, 300 mM NaCl, 10 mM d'imidazole pH 8, ou un autre tampon préféré) contenant du lysozyme (concentration finale de 0,25 mg / ml). Préparer la table de travail du robot: Mettez le tampon de lyse dans un bac de 300 ml à la position 5. Mettez un DW96 propre à la position 11. Mettez les 4 plaques de DW24 x contenant les culots cellulaires (de l'étape 6.1) dans des positions 14-17. Mettez 200 conseils de pi à la position 18. Utilisation de la MCA96 et 200 conseils de pi, aspirer 125 pi de tampon de lyse de la position 5 et distribuer dans chaque plaque DW24 (positions 14-17). Répétez. NOTE: 4 conseils vous distribuer dans un seul puits à la fois pour un volume final de 1 ml dans chaque puits des plaques DW24. Agiter les plaques à des positions 14-17 en utilisant le Te-Shake (1000 rpm) pendant 15 min à remettre en suspension les boulettes. Une fois que les pastilles sont remises en suspension, en utilisant les quatre premiers canaux de la LihA pour aspirer des échantillons de 550 ul de 1 à 4 (de la première colonne de la première DW24, en position 14), puis en utilisant la last 4 voies de la ponction LihA 550 pi d'échantillons de 5 à 8 (la deuxième colonne de la première DW24). Répartir dans la première rangée de la DW96 à la position 11. Répéter l'étape 6.6, de telle sorte que la totalité de la suspension cellulaire est transférée à la DW96. Après chaque série d'échantillons laver les conseils LihA dans la station de lavage. Répétez les étapes 6.6 à 6.8 pour chaque colonne de chaque plaque DW24 (positions 15-17) selon le schéma établi dans la Figure 5. Sceller avec du film plastique. Pour la purification, le même jour ou le gel à court terme, conserver à -80 ° C pendant un minimum de 1 heure, sinon stocker à -20 ° C. Partie B: Purification et analyse 7. Lyse cellulaire NOTE: Cette procédure prend environ 60 minutes à compléter. Décongeler les suspensions de cellules congelées (6,10) à partir de l'étape dans un bain d'eau (à la température ambiante ou 37 ° C) pendant environ 15 min et remettre en suspension dans l'incubateur agitateur pour un unSUPPLEMENTAIRES 10 min. Les cultures devraient devenir visqueux. Prenez 500 pi de DNase actions et mélanger avec 1 ml de MgSO 4 stock. Manuellement à l'aide d'une pipette à 8 canaux ou avec le robot LihA, dispenser 15 pi dans chaque puits de la DW96, pour donner une concentration finale de 10 pg / ml de DNase et 20 mM MgSO4. Re-sceller la plaque avec du ruban plastique et secouer pendant 15 min. A ce stade, les cultures doivent être non-visqueux. Vérifiez soigneusement (par examen visuel) que toutes les cultures ne sont plus visqueux. NOTE: Ceci est essentiel, si certaines cultures sont encore visqueux (par exemple, si la DNase a été accidentellement oubliée ou pas distribuée de façon appropriée dans certains puits), le filtre se bouche, générant une pression inégale sur les échantillons et le débordement ou le colmatage total de la plaque de filtre pourrait se produire au cours de la purification. Pour les échantillons de SDS-PAGE de l'ensemble du lysat cellulaire, aspiration 10 pi de lysat et distribuer dans une plaque de 96 puits PCR contenant10 ul de 4x tampon d'échantillon SDS-PAGE et 20 pi d'eau. Dénaturer pendant 3 min à 95 ° C et congeler jusqu'à l'analyse (fraction totale). Si un système d'électrophorèse HTP est disponible, les échantillons peuvent être analysés sur ce lieu suivant le protocole recommandé par le fabricant pour la préparation des échantillons. Pour plus de détails concernant l'analyse des échantillons voir la section 10. 8. Ni Affinity Purification REMARQUE: Une vitesse d'aspiration lente devrait être utilisée pour le pipetage de toutes les suspensions de résine, comme les suspensions sont assez épais. Sur-séchage de la résine se traduira par une réduction de la capacité de liaison. Pour la purification, les concentrations d'imidazole spécifiées sont applicables à la résine d'affinité au nickel. Si des ions de substitution (par exemple, cobalt) sont utilisés, les concentrations doivent être ajustées en conséquence. A – Ni purification d'affinité pour la détection dans la gamme de 1 à 100 mg / L (volume de résine final = 200 ul) NOTE: Tsa procédure de purification prend environ 1,5 heures à compléter, ce qui signifie que jusqu'à 4 peuvent être réalisées en une seule journée. Préparer la table de travail du robot: Placer 300 ml de creux contenant un tampon de liaison (Tris 50 mM, 300 mM NaCl, 10 mM d'imidazole pH 8), un tampon de lavage (Tris 50 mM, 300 mM NaCl, 50 mM d'imidazole, pH 8) et du tampon d'élution (Tris 50 mM, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8) en positions 6 et 8, respectivement. Laisser un vide de 300 ml creux en position 5 pour la suspension de résine. À la position 9 et 10 détenteurs de la plaque de vente. À la position 10 mettre un DW96 avec le bloc de SPE et la plaque filtre / récepteur (20 mm) sur le dessus. Mettez le DW96 contenant le lysat (de l'étape 7.3) en position 14. A la position 18 et 19 mettre les 200 conseils de forage pi de large et 200 conseils de pi, respectivement. Mettez deux plaques DW96 de rechange pour le lavage et l'élution dans un hôtel. NOTE: Ils pourraient aussi être mis sur un autre site sur la table de travail si un hôtel est indisponible. Préparer 105ml de suspension équilibrée de 33% de résine (35 ml de résine + 70 ml de tampon de liaison). Ajouter la suspension de résine à l'auge à la position 5 immédiatement avant de commencer la procédure. Utilisation de la MCA96 et 200 conseils d'alésage pi de large (position 18), mélanger la pâte de résine à la position 5 à fond avant d'aspirer et de distribution de 200 pi de suspension de résine dans le DW96 contenant le lysat à la position 14. Répétez deux fois pour que 600 pl de suspension de résine a été ajouté au lysat, le mélange de la suspension de résine avant chaque aspiration. Effectuer une étape de mélange de 10 min en utilisant le MCA96 en position 14 pour permettre la liaison et d'empêcher la résine de granulation. Aspirer à partir de la position 14 et se dispenser 800 pi (200 pi dans les lots) sur la plaque de filtre en position 9, le mélange avant chaque aspiration sinon la résine sera retenu au fond de la DW96. Tourner le vide sur la position 10 à environ 90 secondes pour filtrer le lysat travers la plaque dans l'DW96 à recueillir le flux continu, en prenant soin de ne pas sécher la résine. Tournez le vide hors tension. Répéter les étapes 8.1.5 et 8.1.6 de sorte que la totalité de la résine est alors dans la plaque de filtration. Utilisation du bras RoMa déplacer le bloc de SPE tenant la plaque de filtre à partir de la position 10 à la position 9 de sorte que l'étape de lavage suivante va directement à la déchets et transférer le DW96 contenant le flux continu à la position 10 à un autre site (par exemple, dans un hôtel transporteur) jusqu'à la fin de la procédure. Avec une nouvelle série de 200 conseils de pi (position 19), laver la résine (en position 9) avec un total de 800 pi de tampon de liaison (de la position 6), et d'appliquer le vide à la position 9 jusqu'à ce que le tampon a traversé . Répéter une fois de plus. Utilisez le bras RoMa de placer une nouvelle DW96 en position 10 pour recueillir le lavage de 50 mM d'imidazole et déplacer le bloc de SPE et de la plaque de filtre de retour au sommet (poste 10). Ajouter 800 ul de tampon de lavage de la position 7 sur la position 10, tourner lavide jusqu'à ce que le tampon est passé à travers. Éteignez la vide. Avec la ROMA, retirer le bloc de SPE et de la plaque de filtre à la position 9 et la DW96 contenant l'échantillon de lavage à l'hôtel, et garder de côté jusqu'à la fin de la procédure. Laver la résine avec encore 800 ul de tampon de lavage (de la position 7 sur la position 9), appliquer le vide jusqu'à ce que le tampon est passé à travers. Répéter une fois de plus. Utilisez les Roms de placer une nouvelle DW96 en position 10 et placez le bloc de SPE et de la plaque de filtre de retour au sommet de recueillir l'élution. Ajouter un total de 500 ul de tampon d'élution (de la position 8 sur la position 9) et incuber in situ pendant 3 min. Allumez le vide jusqu'à ce que tout tampon a traversé. Facultatif: Pour très exprimant des protéines, une seconde élution peut être réalisée dans une nouvelle DW96 comme dans les étapes 8.1.14 et 8.1.15. Prélever des échantillons de l'écoulement, laver et élution / s pour SDS-PAGE ou électrophorèse HTP. <li> Pour les échantillons SDS-PAGE de l'écoulement, dispense 10 pi dans une plaque de 96 puits PCR contenant 10 pi de 4X tampon d'échantillon SDS-PAGE et 20 pi d'eau. Pour les échantillons de SDS-PAGE du lavage et l'élution / s dispenser 30 pi dans des plaques de PCR contenant 10 ul de 4x tampon d'échantillon SDS-PAGE. Dénaturer pendant 3 min à 95 ° C et congeler jusqu'à l'analyse. Pour les échantillons d'électrophorèse HTP, suivez les instructions du fabricant. Pour plus de détails concernant l'analyse des échantillons voir la section 10. B – Ni purification d'affinité pour la détection dans la gamme de 0,1 à 25 mg / L (volume de résine final = 50 pi) NOTE: Cette procédure de purification prend environ 30 minutes à compléter, ce qui signifie que jusqu'à 12 peut être réalisée en une seule journée. Préparer la table de travail du robot: Placer 300 ml de tampon de liaison contenant des auges (50 mM de Tris, 300 mM NaCl, 10 mM d'imidazole pH 8), le tampon de lavage (Tris 50 mM, 300 mM NaCl, 50 mM d'imidazole pH 8)et un tampon d'élution (50 mM de Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole, pH 8) en positions 6 et 8, respectivement. Laisser un vide de 300 ml creux en position 5 pour la suspension de résine. À la position 9 et 10 détenteurs de la plaque de vente. À la position 10 mettre un DW96 avec le bloc de SPE et la plaque filtre / récepteur (20 mm) sur le dessus. Mettez le DW96 contenant le lysat (de l'étape 7.3) en position 14. A la position 18 et 19 mis 200 pi conseils de grand calibre et 200 conseils de pi, respectivement. Mettez une plaque de microtitration de 96 puits de secours pour l'élution dans un hôtel. NOTE: Ce pourrait également être mis sur un autre site sur la table de travail si un hôtel est indisponible. Préparer 50 ml de suspension équilibrée de 25% de résine (12,5 ml de résine + 37,5 ml de tampon de liaison). Ajouter la suspension de résine à l'auge à la position 5 immédiatement avant de commencer la procédure. Utilisation de la MCA96 et 200 conseils d'alésage pi de large (position 18), mélanger la pâte de résine à la position 5 à fond avant d'aspirer et DispeNsing 200 ul de suspension de résine dans le DW96 contenant le lysat à la position 14. Incuber à température ambiante sous agitation à l'aide du Te-Shake à 1400 rpm pendant 10 min pour permettre la liaison. Aspirer à partir de la position 14 et se dispenser de la pleine 1,200 pi (dans 200 ul lots) en utilisant la pointe d'alésage large (position 18) sur la plaque de filtre en position 10. Mélanger avant chaque aspiration sinon la résine sera retenu au fond de la DW96. Tournez le vide à la position 10 sur environ 30 secondes pour filtrer le lysat à travers la plaque dans le DW96 pour recueillir le flux continu, en prenant soin de ne pas sécher la résine. Tournez le vide hors tension. Utilisation du bras Roma, déplacer le bloc de SPE à maintenir la plaque de filtre de la position 10 à la position 9 de sorte que l'étape de lavage suivant va directement aux déchets et transférer le DW96 contenant le flux continu à la position 10 à un autre site (par exemple, dans un support d'hôtel) jusqu'à la fin de la procédure. Avec les 200 μl Les pointes (19) en position, lavage de la résine (en position 9) avec un total de 800 ul de tampon de liaison (de la position 6), et d'appliquer le vide à la position 9 jusqu'à ce que le tampon est passé à travers. Répétez. Utilisez le bras RoMa de placer le DW96 frais à la position 10 pour recueillir le lavage de 50 mM d'imidazole et déplacer le bloc de SPE et de la plaque de filtre de retour au sommet (poste 10). Ajouter 150 ul de tampon de lavage à partir de la position 7 sur la position 10, tourner le vide jusqu'à ce que le tampon est passé à travers. Éteignez la vide. Avec la ROMA retirer le bloc de SPE et de la plaque de filtre à la position 9 et la DW96 contenant l'échantillon de lavage à l'hôtel, et garder de côté jusqu'à la fin de la procédure. Laver la résine avec encore 800 ul de tampon de lavage (de la position 7 sur la position 9), appliquer le vide jusqu'à ce que le tampon est passé à travers. Répétez. Utilisez les Roms de placer la microplaque à la position 9 et placez le bloc de SPE et de la plaque de filtre de retour au sommet de recueillir èmee élution. Ajouter 190 pi de tampon d'élution (de la position 8 sur la position 9) et incuber in situ pendant 3 min. Appliquer le vide jusqu'à ce que tout tampon a traversé. Prélever des échantillons de l'écoulement, lavage et élution pour SDS-PAGE ou électrophorèse HTP. Pour les échantillons de SDS-PAGE de l'écoulement, distribuer 10 ul dans une plaque de 96 puits PCR contenant 10 pi de 4X tampon d'échantillon SDS-PAGE et 20 pi d'eau. Pour les échantillons de SDS-PAGE du lavage et l'élution / s dispenser 30 pi dans des plaques de PCR contenant 10 ul de 4x tampon d'échantillon SDS-PAGE. Dénaturer pendant 3 min à 95 ° C et congeler jusqu'à l'analyse. Pour les échantillons d'électrophorèse HTP, suivez les instructions du fabricant. Pour plus de détails concernant l'analyse des échantillons voir la section 10. 9. Décolleté Tag (Facultatif) Ajouter la protease TEV (2 mg / ml) de la protéine éluée (de l'étape 08.01.15 (et 8.1,16) ou de l'étape 2.8.14) dans un rapport de 1/10 (v / v). Incuber à température ambiante (ou à 4 ° C pour des protéines sensibles à la température) O / N avec agitation douce. A la fin du clivage distribuer 30 ul dans une plaque PCR contenant 10 pi de 4x tampon d'échantillon SDS-PAGE ou suivre les instructions du fabricant pour les échantillons d'électrophorèse HTP. Filtrer le mélange de clivage restant (de l'étape 9.2) par l'intermédiaire d'un 96 puits de 0,22 um plaque de filtration et de recueillir l'écoulement continu soluble dans un DW96 en appliquant le vide. Cela peut être fait à l'un des sites de vide (par exemple, la position 10) sur le robot de manipulation de liquide, comme pour les étapes d'élution dans les sections 8.1 et 8.2. Cela supprime toute protéine qui précipite lors du clivage. Après filtration, distribuer 30 ul dans une plaque PCR contenant 10 pi de 4x tampon d'échantillon SDS-PAGE ou préparer que des échantillons d'électrophorèse HTP. Ceci permet la comparaison de la protéine avant un clivage, le mélange après le clivage et le solprotéine uble restant après clivage et donne de bonnes indications sur les résultats attendus dans les expériences à grande échelle qui en découlent. Pour plus de détails concernant l'analyse des échantillons voir la section 10. 10. Analyse des résultats Identifier les constructions exprimant la protéine soluble par l'analyse des échantillons de la purification par électrophorèse en SDS-PAGE, transfert en point ou d'un système d'électrophorèse sur HTP tel que l'étrier LabChip. Analyser les échantillons d'élution premier à identifier des structures de production de protéines solubles. Dans la plupart des cas, seuls les échantillons d'élution sont analysées si les constructions solubles sont identifiés, afin de minimiser le temps consacré à l'analyse. Si la protéine n'est pas dans l'élution, exécuter les échantillons de lavage et accréditives pour voir si elle a été exprimée et ne se lie pas correctement à la résine. Pour des constructions où aucune protéine soluble peut être détectée toute la course lysat de cellules pour voir si la protéine a été exprimée. REMARQUE: Une limitation ici est que si le protein d'intérêt n'est pas présente les niveaux d'expression de fond ci-dessus, il peut ne pas être possible de voir la protéine et pourrait conduire à un faux négatif. Il est à noter qu'il est toujours possible pour des protéines à coller et précipitent sur la résine d'affinité, ce qui pourrait conduire à un faux négatif ou une sous-estimation du rendement en utilisant le protocole recommandé (un événement rare dans cet ouvrage). Dans le cas où la protéine précipite par élution (un culot blanc est visible une minute quelques / heure après élution), il est recommandé de modifier la composition de la mémoire tampon (par exemple, concentration en sel) et / ou d'effectuer un test à balayage différentiel de la fluorimétrie à optimiser l' des tampons. Un petit échantillon de la résine peut également être remis en suspension dans du tampon d'échantillon SDS-PAGE et on fait bouillir pour détecter si une protéine est retenue sur la résine. Si la protéine n'est pas exprimée, mais les cellules ne se développer, poursuivre une nouvelle stratégie d'expression, ou si la DO 600 n'était pas assez élevé repousser et réanalyser la culture. </li > Si les échantillons de clivage doivent être analysés, ils doivent être analysés d'une manière côte à côte, de sorte que chaque produit d'assemblage peut être établi avant un clivage après le clivage dans des voies adjacentes, afin de simplifier l'analyse. A moins d'utiliser un procédé qui donne une quantification directe de la concentration d'élution, la quantification doit être effectuée pour les échantillons positifs par mesure de l'absorbance à 280 nm (A280). Mesurer la A280, en prenant le coefficient d'extinction de la protéine en compte et en utilisant le tampon d'élution comme une ébauche, pour fournir une estimation de rendement en protéines dans le but d'identifier les produits d'assemblage exprimant solubles plus élevées. Pour la comparaison des rendements plus fiable solubles, il est recommandé de normaliser les rendements par la densité de la culture (en utilisant la mesure de la DO 600), qui a été prise à la section 5. Si toutes les cultures ont atteint à peu près la même densité, la normalisation n'est pas requise. e «Contrôle qualité> 11. Les échantillons peuvent être analysés directement à partir de l'élution ou de l'échantillon de clivage par spectrométrie de masse-chromatographie en phase liquide (LC / MS). Sinon, dessaler premier (pour éliminer l'imidazole et des sels tampons qui peuvent être présents) à l'aide des embouts de pipette ZipTip ou des méthodes de chromatographie en phase liquide, puis analyser par désorption laser assistée par matrice / ionisation temps de vol (MALDI-TOF) ou ionisation par électrospray ( ESI) spectrométrie de masse. Études fonctionnelles à petite échelle peuvent être réalisés pour vérifier si la fonction de la protéine est comme prévu. Si de grandes quantités sont nécessaires pour la fonction, une culture de mise à l'échelle peut être faite et la fonction testée à partir de la culture plus grande taille et une fois l'état d'oxydation ont été confirmés à petite échelle.