عالية الإنتاجية التعبير الكمي فحص وتنقية تطبق على المؤتلف ثاني كبريتيد الغنية البروتينات السم المنتجة في<em> E. القولونية</em
Summary
يوصف بروتوكول للكمية، وارتفاع الإنتاجية التعبير فحص وتنقية التحليلية من البروتينات الانصهار من الثقافات على نطاق صغير القولونية وتطبيقه على التعبير عن أهداف البروتين المركب من السم حيوان ثاني كبريتيد الغنية.
Abstract
الإشريكية القولونية (E. كولاي) هو النظام الأكثر استخداما على نطاق واسع التعبير لإنتاج البروتينات المؤتلف للدراسات الهيكلية والوظيفية. ومع ذلك، وتنقية البروتينات يشكل تحديا في بعض الأحيان منذ يتم التعبير عن العديد من البروتينات في شكل غير قابل للذوبان. عند العمل مع الاهداف الصعبة أو متعددة لذلك ينصح باستخدام إنتاجية عالية (بالمشاركه) فحص البروتين التعبير على نطاق صغير (1-4 مل الثقافات) لتحديد الظروف بسرعة للتعبير قابلة للذوبان. للتعامل مع مختلف برامج الجينوميات الهيكلية للمختبر، والكمية (ضمن مجموعة من ،1-100 ملغم / لتر ثقافة البروتين المؤتلف) ونفذ البروتين بالمشاركه بروتوكول الفحص التعبير والتحقق من صحتها على الآلاف من البروتينات. تم الآلي البروتوكولات مع استخدام الروبوت التعامل مع السائل ولكن يمكن أيضا إجراء يدويا بدون المعدات المتخصصة.
تكتسب البروتينات السم، ثاني كبريتيد الغنيةاعتراف متزايد لإمكاناتهم كما يؤدي العقاقير العلاجية. يمكن أن تكون قوية للغاية وانتقائية، ولكن شبكات السندات ثاني كبريتيد المعقدة التي جعلها صعبة لإنتاج. كعضو في مشروع FP7 Venomics الأوروبية ( www.venomics.eu )، التحدي الذي يواجهنا هو تطوير استراتيجيات الإنتاج الناجحة بهدف إنتاج الآلاف من البروتينات السم الرواية لتوصيف وظيفي. بمساعدة من خصائص الأكسدة من السندات ثاني كبريتيد مصاوغة DsbC، ونحن تكييفها خط الانتاج بالمشاركه دينا للتعبير عن أكسدة، الببتيدات السم وظيفية في E. السيتوبلازم القولونية. البروتوكولات تنطبق على إنتاج البروتينات ثاني كبريتيد الغنية المتنوعة أيضا. نحن هنا لشرح خط أنابيب لدينا تطبيقها على إنتاج البروتينات الحيوانية السم. مع بروتوكولات الموصوفة هنا فمن المرجح التي سيتم الحصول عليها بروتينات قابلة للذوبان في ثاني كبريتيد الغنية اقل من أسبوع. حتى من نطاق صغير، هناك احتمال لاستخدام اله تنقية البروتينات للتحقق من صحة وحالة الأكسدة بواسطة مطياف الكتلة، لتوصيف في الدراسات التجريبية، أو لفحوصات الحساسة الدقيقة.
Introduction
بدافع النهوض الجينوميات وتسارع معدل اكتشاف بروتينات جديدة، تم تطوير خطوط الأنابيب إنتاجية عالية ليوازي الأساليب التقليدية لفحص وتحديد استراتيجيات إنتاج البروتين الأمثل. وتشمل المتغيرات المحتملة ليكون الأمثل، ولكن ليس على سبيل الحصر، سلالات متفاوتة التعبير 1،2، 3،4 درجة الحرارة، ووسائل الإعلام 2،3، الهدف المتغيرات 5، شركاء الانصهار 6-13، وشارك في التعبير مع المحرمين 14،15، هيولي أو محيط بالجبلة التعبير 16-18، والعازلة تنقية مكونات 3. من خلال تنفيذ النهج إنتاجية عالية، العديد من المتغيرات أو العديد من الأهداف يمكن اختبار بالتوازي مع مستوى عال من الكفاءة، مع الحد من التباين دفعة إلى دفعة. في تجربتنا، كما يعطي استراتيجية استنساخ جيدة على نطاق المتابعة باستخدام نفس الثقافة (درجة الحرارة، ووسائل الإعلام، التهوية، الخ) والظروف تنقية (نفس ريسين، ومخازن، وغيرها). وقد استخدمت العديد من منصات إنتاجية عالية في العقد الماضي لتحديد الظروف الملائمة لذوبان البروتين التعبير، أي من خلال المعلمات متفاوتة مثل الشركاء الانصهار، والسلالات التعبير أو درجة حرارة 19-23.
كنا مؤخرا نهجنا فحص إنتاجية عالية للتعبير عن ذوبان في ثاني كبريتيد الغنية البروتينات 11. كانت البروتينات المحددة ليس فقط من مصادر السامة، ولكن شملت أيضا مثبطات انزيم ثاني كبريتيد الغنية من مجموعة واسعة من الأنواع بما في ذلك النباتات والخنازير والأبقار والبشر. مقارنة التجربة آثار 12 شركاء الانصهار مختلفة وثلاث سلالات مختلفة التعبير على الذوبان وقابلة للطي من 28 البروتينات شبكية ثاني كبريتيد. أثبتنا أن استخدام DsbC كشريك الانصهار للإنتاج في BL21 سلالة (DE3) pLysS outproduced إلى حد كبير (في كل من المحصول وعدد من البروتينات القابلة للذوبان التي تم الحصول عليها) أي تركيبة أخرى من سلالة والانصهار اختبار 11. النتائج هذه التجربة شكلت الأساس للتكيف لدينا خط أنابيب الأصلي إنتاجية عالية عموما (والتي تم استخدامها لفحص التعبير عن مجموعة واسعة من البروتينات) 22،24 في واحدة أكثر ملاءمة للتعبير عن أهداف ثاني كبريتيد الغنية. البروتينات ثاني كبريتيد الغنية من السموم الحيوانية ذات أهمية خاصة. السموم هي خليط معقد من الببتيدات النشطة بيولوجيا والبروتينات، مع القيمة المحتملة عقاقيري وعلاجيا. ومع ذلك، التعبير عن ثاني كبريتيد البروتينات المحتوية على السندات ليست تافهة. تحتوي هذه البروتينات عادة ما بين 1-7 السندات ثاني كبريتيد، ويجب أن تتأكسد مع أنماط ثاني كبريتيد-الترابط الصحيح من أجل أن تكون نشطة. حاليا، يتم استخدام منصة لفحص التعبير عن عدد كبير من البروتينات الحيوانية السم ثاني كبريتيد الغنية كجزء من المشروع الأوروبي FP7 VENOMICS (www.venomics.eu) والقياس بروتوكولات الرواية للتعبير إنتاجية عالية الآلاف من الأهداف . هنا، أسلوب مؤتمتوتقدم لإنتاجية عالية الصغيرة الفرز التعبير وتنقية (انظر الشكل 1) تطبق على ثاني كبريتيد الغنية البروتينات الحيوانية السم. استراتيجية ثاني كبريتيد الببتيدات والبروتينات الغنية يستخدم علامة HIS لتنقية والشريك الانصهار الأكسدة الفعالة، DsbC، وخلق شطورة اندماج HIS-DsbC إلى البروتينات المستهدفة (انظر الشكل 2).
في حين أن التركيز من البروتوكولات هو أتمتة هنا باستخدام السائل التعامل مع الروبوت وبالمشاركه الكهربائي، وهذه الأساليب هي أيضا مناسبة عن دليل نهج إنتاجية عالية، وهذا يعني أنه حتى مع مختبرات الإعداد الأساسي يمكن الاستفادة من البروتوكولات دون أي شرط مسبق لمعدات باهظة الثمن . وقد نشرت البروتوكولات دليل للتحول إلى تنقية وتحليل (ليست محددة لبروتينات ثاني كبريتيد الغنية) في أي مكان آخر و24 لن تتكرر هنا. مرت من الإجراء اليدوي (من استنساخ التعبير، التي تنتجها recombiالاستنساخ الوطني 25، لتحليل مستويات البروتين للذوبان) 96 (باستخدام الكشف SDS-PAGE) أو 384 (4 × 96، واستخدام لطخة نقطة وSDS-PAGE 26) الثقافات في الأسبوع (انظر الشكل 1). هذا ويمكن زيادة إذا أجريت بطريقة شبه الآلي (باستخدام الروبوت التعامل مع السائل وصمة عار نقطة أو 26 بالمشاركه الكهربائي، كما هو الحال مع نظام الفرجار GXII LabChip 22 لتحليل النتائج) لتصل إلى 1،152 (12 × 96) الثقافات بالتوازي أكثر من أسبوع واحد، كما هو موضح هنا. يتم إجراء زراعة في بئر عميقة 24 (DW24) شكل بحيث حاضنات تهز العادية يمكن استخدامها على النقيض من الثقافات التي تزرع في بئر عميقة 96 (DW96) شكل، والتي تستلزم استخدام قصيرة المدارية حاضنات عالية السرعة تهتز للتهوية كافية (الهز في 800 دورة في الدقيقة). استخدام وسائل الإعلام لصناعة السيارات في الحث 27 أيضا يبسط التعبير، والقضاء على خطوة الاستقراء دليل. حتى عندما تستخدم بالفعل مختبرات التعبير وبوري محددة مسبقاشروط fication، وهذه يمكن نقلها مباشرة إلى هذا النظام بالمشاركه ببساطة لتحسين الكفاءة. ويرد تخطيطي مفصل للأنابيب فحص إنتاجية عالية للبروتينات ثاني كبريتيد الغنية في الشكل 3. تم تحديد المعلمات في خط أنابيب استنادا إلى تجارب واسعة الفرز 11، 22، الأمر الذي سمح لنا لاختيار الظروف الأكثر فائدة للإنتاج البروتين.
توصيف يمكن أن يؤديها على البروتينات الموسومة تنقية مباشرة من التعبيرات الصغيرة في دراسات تجريبية حيث عشرات ميكروغرام من عينة كافية، أو لفحوصات وظيفية حساسة وفحوصات ملزمة (على سبيل المثال، نظم انخفاض حجم بالمشاركه التصحيح المشبك 28). لا يمكن للنفس حتى يتم تنفيذ أهداف على معلم بعد الانقسام، شريطة أن يتم إزالة علامة والبروتيني (على سبيل المثال، من خلال عكس المرحلة HPLC). ويمكن أيضا لمراقبة الجودة أن يقوم بها مطياف الكتلة (للتأكد من حجم المتوقع والأكسدة الحادي وأكلت) أو طرق الكروماتوغرافي (لتأكيد نقاء أو عدم التجانس) 29. في بعض الأحيان علامة الانقسام غير ضروري أو حتى مرغوب فيه (ولا سيما بالنسبة للبروتينات قابلة للذوبان ضعيفة 30،31)، لذلك في هذا الانقسام بروتوكول اختياري. بغض النظر، في جميع بنيات هناك TEV البروتيني انشقاق موقع (ENLYFQ / [G] 32) التي سبقت مباشرة الجين المستهدف لإنتاج البروتين الأصلي بعد الانقسام (انظر الشكل 2 ومناقشة). إذا كان المطلوب الانقسام العلامة الانصهار، ويمكن اختبار الانقسام (على الكسر أو شطف "على عمود ') في نطاق صغير لتحليل الكفاءة، وتحسين الظروف إذا لزم الأمر والحصول على تقديرات موثوقة للعائدات للتجارب نطاق المتابعة اللاحقة.
هناك خياران لحجم حبات استخدمت خلال تنقية تقارب، تبعا لأهداف وتطلعات التجربة. لتكون قادرة على التقاط أكبر قدر ممكن من البروتين (لتنقية لفحوصات تجريبية أو MS، أو لextrapolيأكلون الغلة النطاق متابعة) وينبغي أن تستخدم الحجم النهائي من 200 ميكرولتر من الراتنج، مما يتيح الكشف عن البروتينات القابلة للذوبان في مجموعة من 1-100 ملغ / لتر الثقافة قبل تشبع النظام (انظر بروتوكول (A) في القسم 8.1) . ومع ذلك، إذا كان الهدف من هذه التجربة هو الكشف عن كميات قليلة من البروتينات القابلة للذوبان ثم الحجم النهائي من 50 ميكرولتر من الراتنج هو مناسب، مما يسمح للكشف عن البروتين للذوبان في حدود 0،1 حتي 25 ملغ / لتر الثقافة (انظر البروتوكول (B ) في القسم 8.2).
يمكن زيادتها إنتاج ما يصل، إذا لزم الأمر، للحصول على كميات مليغرام من الأهداف تنقيته لمزيد من الدراسات البنيوية والوظيفية باستخدام الظروف المحددة للتعبير قابلة للذوبان. وقد نوقشت تفاصيل البروتوكولات المستخدمة على نطاق والمتابعة في أماكن أخرى AFMB 22،24.
مزيد من التفاصيل ذات الصلة الإعداد التجريبية، الخطوات الحاسمة في البروتوكول، وتقدم التعديلات وإصلاح الأعطال والقيود المفروضة على التقنية في القرصussion. يرجى قراءة المناقشة قبل بدء التجارب.
في جميع أنحاء بروتوكولات نتوقع نسبة نجاح 90٪ في كل خطوة (على سبيل المثال، لا يقل عن 90٪ من الثقافات يجب أن تنمو في أي خطوة معينة). إذا كان معدل نجاح أي خطوة في التجربة يسقط أقل من 90٪ يتم تجاهل العينات ويتم تكرار التجربة لمجموعة كاملة من بنيات. ومع ذلك، وهذا معدل نجاح لا ينطبق على عدد من البنى التي تعبر عن البروتينات القابلة للذوبان مثل أو نسبة التركيبات التي يلتصق بكفاءة 100٪، وهذا سوف تعتمد بشكل كبير على البروتينات التي تم اختبارها.
يتم تقديم تفاصيل محددة لمجموعة المتابعة من المنضدة روبوت لكل بروتوكول (أيضا انظر الشكل 4)، إلا أنها يمكن تكييفها على النحو المطلوب لالمنضدة بديل مجموعة عمليات. الأجهزة الروبوت (TECAN) ويتكون من ذراع 96-الأقنية (MCA96)، مناور الروبوتية (الغجر) و8 قنوات الرأس مناولة السائل (يحة). ويمكن أيضا الاستفادة من جميع الخطوات MCA96 أن يؤديها باستخدام يحة إذا كان MCA96 غير متوفرة، إلا أنها ستستغرق وقتا أطول لأن يحة سوف تحتاج إلى أن تغسل بين الخطوات. في حين أن الروبوت هو تقنيا ليس بيئة معقمة، وإدراج المضادات الحيوية عموما يضمن أنه لا توجد مشاكل مع التلوث أو العقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
ليس هناك بروتوكول عالمي واحد للتعبير عن ذوبان، مطوية، والبروتينات وظيفية. أن تكون التكاليف والوقت فعالة، معظم المختبرات أو المرافق الأساسية من البروتين العمل مع أهداف متعددة وبالتالي استخدام عالية الإنتاجية التعبير البروتين فحص للعثور على أفضل مزيج 'عام' من المتغيرات للحصول على البروتين النشط للذوبان بالنسبة لغالبية الأهداف. حددنا DsbC باعتبارها شريكا الانصهار المطبقة عموما للتعبير قابلة للذوبان من الببتيدات والبروتينات الغنية ثاني كبريتيد 11. باستخدام اندماج DsbC وأساليب إنتاجية عالية، في غضون أسبوع التعبير القابلة للذوبان من أهداف متعددة يمكن ملاحظة 11 ثم متغيرات إضافية، مثل تلك التي نوقشت في المقدمة، ويمكن عرضه في الجولات اللاحقة على تلك الأهداف التي تتطلب مزيدا من التحسين. وتهدف البروتوكولات الموصوفة هنا في التعبير عن البروتينات ثاني كبريتيد الغنية والببتيدات. ومع ذلك، بالنسبة للمستخدمين الذين يرغبون في إكسبالبروتينات غير شبكية ريس بطريقة إنتاجية عالية، وقد نشرت البروتوكولات المقابلة سابقا ويمكن العثور عليها في أي مكان آخر 22،24.
الإعداد إنتاجية عالية مثالية لعدد من التطبيقات، بما في ذلك فحص عدد كبير من البروتينات المختلفة للتعبير قابلة للذوبان أو فحص عدد كبير من بنيات التعبير (بما في ذلك مختلف الانصهار به) لعدة الجينات المستهدفة في نفس الوقت ( أو التعبير متعددة يبني لهدف واحد) من أجل تحسين معدلات النجاح. ويمكن أيضا أن تستخدم منصة لقياس والتحقق من بروتوكولات جديدة على عدد كبير من الأهداف. وتشمل التطبيقات الأخرى فحص المتغيرات لهدف صعب واحد، على سبيل المثال، كل orthologs أو أفراد من عائلة واحدة، أو لاختبار نجاح الإنتاج من لجنة من المسوخ من هدف واحد في تجربة واحدة. كما تم استخدام هذا البروتوكول في تركيبة مع ناقلات شارك في التعبير (الطرافة ح واحد الموسومة البروتين فقط) للسماح للالمنسدلة وتوصيف الأولية للمجمعات البروتين البروتين يتبعه أكثر تحليل شامل الفيزيائية الحيوية لتأكيد تشكيل معقدة الصحيح والعناصر المتفاعلة 33. كمية البروتين المنقى مناسبة في بعض الأحيان لفحوصات الدقيقة (اختبارات وظيفية، البروتين DNA 34 أو البروتين البروتين المقايسات التفاعل). وهناك العديد من المزايا للإنتاجية عالية استراتيجية الفحص التعبير: (ط) القدرة على اختبار عدد كبير من الأهداف أو عدد كبير من المتغيرات في تجربة واحدة، (ب) الاختلاف محدودة دفعة إلى دفعة، (ج) و البساطة وسهولة العمل على نطاق أصغر باستخدام الآبار العميقة، (د) قابلية التوسع والتكاثر في نطاق أوسع، (ت) إمكانية التشغيل الآلي، و (السادس) بساطة تتبع والتعامل مع (أي وسم أنابيب الفردية، وأقل أخطاء أدخلت عند استخدام شكل لوحة من التعامل مع أنابيب الفردية في خلط أو تبادل من الحيوانات المستنسخة).
<p الطبقة = "jove_content"> على الرغم من أن لم تناقش في قسم البروتوكول، وهناك العديد من الاعتبارات الهامة لإعداد التجربة التي سيتم مناقشتها بإيجاز أدناه. للاطلاع على مناقشة أكثر شمولا يرجى الاطلاع على المنشور السابق 24. لأقصى قدر من الكفاءة، من المفيد أن يكون هناك نظام مناسب لإنتاجية عالية الاستنساخ، لتبسيط الاستنساخ الفرعي أعداد كبيرة من الأهداف. للمرحلة الأولى من المشروع VENOMICS، ونحن الاستفادة من نظام إعادة التركيب تنوعا بوابة 25 التي تسمح subcloning في أي ناقلات الوجهة بوتيرة مئات من الحيوانات المستنسخة في الأسبوع. بروتوكولات لبوابة إعادة التركيب الاستنساخ ويمكن الاطلاع على موقع إينفيتروجن. وتشمل بدائل أخرى لإنتاجية عالية الاستنساخ-ربط مستقلة الاستنساخ (LIC) 35،36 وخالية من التقييد (RF) استنساخ 37. هناك طرق متعددة للحصول على الجينات المستهدفة للتعبير، بما في ذلك عن طريق الحمض النووي PCR من القالب، من مجموعات استنساخ دخول أو كماالجينات الاصطناعية، والتي هي الاستراتيجية المختارة للمشروع VENOMICS. ويمكن طلب الجينات الاصطناعية مع مواقع إعادة التركيب على كل نهاية التوليف الجيني والجينات يتيح سهولة الأمثل كودون تسلسل الجين الهدف (استبعاد نادرة E. القولونية الكودونات). ويوصى هذا ولكنه ليس أساسيا. للأهداف دون كودون الأمثل التي تحتوي على عدد كبير من كودونات نادرة، رشيد 2 (DE3) pLysS (الذي يحمل tRNAs للكودونات النادرة التي لا يتم التعبير عن غاية في كولاي) قد يكون أكثر ملاءمة من BL21 (DE3) pLysS. في حين أن هناك سلالات المتاحة التي تحد من خفض السندات ثاني كبريتيد في البيئة والحد من عادة السيتوبلازم، في أيدينا أنها لم تكن ناجحة كما E. العادية القولونية سلالات 11.يتم إجراء تنقية تقارب نطاق والتحليلية من الثقافات اختبار التعبير من أجل استرداد البروتينات القابلة للذوبان والانصهار تقدير الغلة. ويمكن الحصول على البيانات الكمية على اله غلة قابلة للذوبان البروتينات الانصهار أعرب ضمن مجموعة من ،1-100 ملغ / لتر من الثقافة. إذا كان الهدف غير قابل للذوبان والتعبير والحث درجات الحرارة البديلة، والسلالات أو وسائل الإعلام يمكن اختبارها قبل أن يتم السعي شركاء الانصهار مختلفة. للتعبير عن ذوبان البروتينات ثاني كبريتيد الغنية، ونحن في المرتبة سابقا تأثير شركاء الانصهار كما DsbC> DsbA> GST> MBP> TRX> HIS علامة للتعبير حشوية 11. التعبير محيط بالجبلة هو احتمال آخر قد تساعد للطي الناجح لأهداف ثاني كبريتيد الغنية. والجبلة المحيطية هي بيئة خفض أقل من السيتوبلازم ويحتوي على المحرمين الأكسدة مفيدة لمساعدة ثاني كبريتيد الترابط. يتم ترجمة DsbC، DsbA، وMBP البروتينات عادة إلى الجبلة المحيطية التي كتبها متواليات إشارة محيط بالجبلة بهم. هذا يتيح الفرصة لاستغلال هذه العلامات لتوجيه أهداف ثاني كبريتيد الغنية إلى الفضاء محيط بالجبلة من أجل مساعدة للطي. لأهداف مستعصية على الحل، فإن الخطوة التالية هي عurify الهدف غير قابلة للذوبان HIS الموسومة من الهيئات إدراج، وذوبان refold (هذا هو خارج نطاق هذا البروتوكول ولن يتم مناقشتها هنا 3 9). وهذا يمكن أن يكون بسيطا إلى حد ما للأهداف مع واحد فقط أو اثنين من السندات ثاني كبريتيد، ولكنه يصبح أكثر صعوبة حيث بلغ عدد السندات ثاني كبريتيد الزيادات. بدلا من ذلك، وخاصة بالنسبة للبروتينات والببتيدات مع أربعة أو أكثر من السندات ثاني كبريتيد، فإنه قد يكون من المفيد محاولة نظم الإنتاج أكثر تعقيدا مثل الخميرة، أو التعبير الحشرات الثدييات.
مع التقدم في التصغير والأتمتة، سوف بالمشاركه الكهربية المختبر على واحد في رقاقة التكنولوجيات 28 سيكون بلا شك طريق المستقبل للتحليلات الوظيفية. ونحن نتصور أن لمعظم الأغراض (ربما باستثناء الدراسات البنيوية) وهذا سوف ينفي الحاجة إلى الثقافات على نطاق واسع. سوف الثقافات الصغيرة أن تكون مفيدة ليس فقط لفحص ظروف التعبير، ولكن أيضا أن تكون قادرة على توفير SUFتبلغ ficient من العينة لهذه المقايسات الفنية المنمنمة. فإن القدرة على إنتاج أهداف متعددة بالتوازي بكميات كافية لتوصيف وظيفي خفض تكاليف زراعة واستخدام هذا النوع من المنصات، والتعبير وتوصيف البروتينات المؤتلف تصبح أكثر تكلفة وفعالية من حيث الوقت.
البروتوكولات هنا تم تطبيقها على التعبير عن الببتيدات والبروتينات الغنية ثاني كبريتيد في المرحلة الأولية للمشروع FP7 VENOMICS الأوروبي. السموم هي مصدر ممتاز من الببتيدات النشطة بيولوجيا التي غالبا ما تنطوي على إمكانات الدوائية مثيرة للاهتمام. ومع ذلك، إنتاجها يمثل تحديا بسبب أنماط معقدة ثاني كبريتيد الربط، وحجمها صغير. باستخدام منصات عالية الإنتاجية مثل واحد الموصوفة هنا، يهدف المشروع VENOMICS لإنشاء مكتبة من 10،000 الببتيدات السم رواية لإعادة إنتاج التنوع التي لوحظت في الطبيعة. سوف تستغل هذه المكتبة لتوصيف ثاني كبريتيد-Rالببتيدات معنوى مع الدوائية المحتملة أو التطبيقات العلاجية بهدف تطوير أدوية جديدة. ويجري حاليا استخدام منصة لقياس والتحقق من صحة بروتوكولات جديدة لاستخدامها في المشروع VENOMICS.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المشروع VENOMICS والأوروبية منحة المشروع N ° 278346 من خلال برنامج الإطاري السابع (FP7 الصحة 2011-2015). المشروع VENOMICS هو التعاون بين عدة مؤسسات البحوث والشركات في أوروبا:
AFMB، إيكس مرسيليا جامعة (فرنسا)، CEA Saclay (فرنسا)، NZYTech (البرتغال)، SistemasGenomicos (إسبانيا)، جامعة لياج (بلجيكا)، VenomeTech (فرنسا)، Vitamib (فرنسا)، نيوزيلندا فارما (الدنمارك)
وأيد هذا العمل من قبل البنية التحتية الفرنسية لعلم الأحياء الإنشائية المتكاملة (FRISBI) ANR-10-INSB-05-01.
فإن الكتاب أود أيضا أن أشكر السيد جيريمي Turchetto للمساعدة في التحضير للإطلاق النار على الفيديو.
Materials
| Tecan Freedom EVO 200 liquid handling robot | Tecan Group Ltd. | Protocols can be adapted to any liquid handling robot with a vacuum manifold for plates. http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2694&ID=5270&Menu=1&Item=21.1.8 |
|
| 96-well PCR (PCR96) plates | Greiner Bio-One | 652270 | http://us.gbo.com/bioscience/detail/2504/ |
| LB medium | Autoclaved for sterility. | ||
| Antibiotic stocks | Kanamycin (50 mg/ml), Ampicillin (100 mg/ml), Chloramphenicol (34 mg/ml in ethanol), store stocks at -20 °C. Use a 1 in 1000 dilution. | ||
| Deep-well 96 (DW96) plate with 2.42 ml volume capacity | Greiner Bio-One | 780270 | Autoclaved for sterility. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2462/ |
| Expression vectors | For the expression of target constructs. Store at −20 °C. | ||
| BL21 (DE3) pLysS competent cells | Or alternative E. coli expression strain of the user's choice. Store at −80 °C. | ||
| Breathseal breathable adhesive film | Greiner Bio-One | 676050 | |
| PCR machine with 96-well plate block | For the transformation heat shock and boiling of SDS-PAGE/Caliper samples. | ||
| 24-well sterile tissue culture plates | Greiner Bio-One | 662165 | http://us.gbo.com/bioscience/detail/2220/ |
| LB-agar | Autoclaved for sterility. | ||
| 200 μl sterile disposable tips | Tecan Group Ltd. | 30 038 617 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
| Multitron Shaking Incubator, with 3 mm throw | Infors | AJ103 | Not essential, a regular shaking incubator can also be used. http://www.infors-ht.com/index.php/en/ |
| Plate incubator | |||
| Microtiter plate | For glycerol stocks and elution using purification protocol B. | ||
| Glycerol | For the preparation of glycerol stocks. | ||
| 200 μl disposable tips | Tecan Group Ltd. | 30 038 616 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
| Adhesive tape pads | Qiagen | 19570 | http://www.qiagen.com/Products/Catalog/Lab-Essentials-and-Accessories/Tape-Pads |
| Bactinyl | Orapi Group | Or equivalent microbial disinfectant. | |
| ZYP-5052 medium | See Table 1 for recipes of components. | ||
| Deep well 24 (DW24) plates,10 ml capacity | Whatman | 7701-5102 | Autoclaved for sterility. http://www.whatman.com/UNIPLATECollectionandAnalysisMicroplates.aspx#7701-5102 |
| Flat-bottomed, clear microtiter plate | Greiner Bio-One | 655101 | For absorbance readings. http://us.gbo.com/bioscience/detail/2029/ |
| Plate reading spectrophotometer | Optional. For measuring OD600nm of cultures. | ||
| Centrifuge with rotor for deep well plates | Suitable for 3800 x g. | ||
| Lysozyme | 50 mg/ml in water. Store at −20 °C. | ||
| Imidazole ACS grade | Merck | IX0005-1 | A high quality grade of imidazole must be used so that it will not interfere with A280 readings for calculating protein yield. |
| Lysis buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 containing 0.25 mg/ml lysozyme (or your preferred buffer). Add lyzozyme from stocks each time and do not store for extended periods. | ||
| Water bath | |||
| Plate sonicator (Ultrasonic processor XL, adapted for deep well plates) | Misonix Inc. | Not essential. Lysozyme alone is normally sufficient for nearly complete lysis. | |
| DNase | 2 mg/ml stock in water, filter sterilized. Store aliquots at −20 °C. | ||
| Magnesium sulphate (MgSO4) | 2M stock in water, autoclaved. | ||
| SDS-PAGE or Caliper sample buffer | |||
| Binding buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 10 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
| Wash buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 50 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
| Elution buffer | 50 mM Tris, 300 mM NaCl, 250 mM imidazole pH 8 (or your preferred buffer). Store at 4 °C. | ||
| 96-well Receiver/Filter Plate 20 µm, 1.8 ml capacity | Macherey-Nagel | 740686.4 | http://www.mn-net.com/ProductsBioanalysis/Accessories/tabid/10909/language/en-US/Default.aspx |
| 200 μl disposable wide bore tips | Tecan Group Ltd. | 30 050 348 | http://www.tecan.com/platform/apps/product/index.asp?MenuID=2283&ID=4118&Menu=1&Item=21.4.1.2 |
| Ni Sepharose 6 Fast Flow resin | GE Healthcare | 17-5318-02 | For purification of target fusion proteins. Store at 4 °C. Wash and equilibrate before use. http://www.gelifesciences.com/webapp/wcs/stores/servlet/productById/en/GELifeSciences/17531802 |
| Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Optional, for cleavage. 2 mg/ml, without reducing agents in storage buffer. Store at −80 °C. | ||
| 96-well 0.22 µm filter plate | Millipore | MSGV N22 10 | Optional. To filter the soluble fraction after cleavage. http://www.millipore.com/catalogue/item/msgvn2210 |
| SDS-PAGE/dot blot equipment or Caliper Labchip GXII equipment | Electrophoresis apparatus and choice of gel type is at the user’s discretion. | ||
| Spectrophotometer and cuvettes | For measuring absorbance at 280 nm (A280) to calculate yield of soluble proteins. Not required if the analysis is done on the Caliper. | ||
| ZipTip pipette tips | Millipore | Optional. The type of ZipTip is at the user's discretion. C4 resin should be used for larger proteins, while for peptides C18 may be better. Alternative methods for desalting of samples may also be used to clean up samples before further quality control. http://www.millipore.com/catalogue/module/c5737#0 |
|
| Materials are listed in the order in which they are required in the Protocol section. Reagents can be stored at room temperature unless noted otherwise. Reference numbers for the author’s preferred choice of materials are provided, however equivalent products may also be suitable. For reagents where the brand will not influence the outcome of the experiment, the company details have been omitted. |
References
- Berrow, N. S., et al. Recombinant protein expression and solubility screening in Escherichia coli: a comparative study. Acta Crystallographica Section D-Biological Crystallography. 62, 1218-1226 (2006).
- Correa, A., Oppezzo, P. Tuning different expression parameters to achieve soluble recombinant proteins in E. coli: advantages of high-throughput screening. Biotechnol J. 6, 715-730 (2011).
- Graslund, S., et al. Protein production and purification. Nat Methods. 5, 135-146 (2008).
- Vera, A., Gonzalez-Montalban, N., Aris, A., Villaverde, A. The conformational quality of insoluble recombinant proteins is enhanced at low growth temperatures. Biotechnol Bioeng. 96, 1101-1106 (2007).
- Graslund, S., et al. The use of systematic N- and C-terminal deletions to promote production and structural studies of recombinant proteins. Protein Expr Purif. 58, 210-221 (2008).
- Bird, L. E. High throughput construction and small scale expression screening of multi-tag vectors in Escherichia coli. Methods. 55, 29-37 (2011).
- Davis, G. D., Elisee, C., Newham, D. M., Harrison, R. G. New fusion protein systems designed to give soluble expression in Escherichia coli. Biotechnol Bioeng. 65, 382-388 (1999).
- Kapust, R. B., Waugh, D. S. Escherichia coli maltose-binding protein is uncommonly effective at promoting the solubility of polypeptides to which it is fused. Protein science: a publication of the Protein Society. 8, 1668-1674 (1999).
- LaVallie, E. R., Lu, Z., Diblasio-Smith, E. A., Collins-Racie, L. A., McCoy, J. M. Thioredoxin as a fusion partner for production of soluble recombinant proteins in Escherichia coli. Methods Enzymol. 326, 322-340 (2000).
- Marblestone, J. G., et al. Comparison of SUMO fusion technology with traditional gene fusion systems: enhanced expression and solubility with SUMO. Protein science: a publication of the Protein Society. 15, 182-189 (2006).
- Nozach, H., et al. High throughput screening identifies disulfide isomerase DsbC as a very efficient partner for recombinant expression of small disulfide-rich proteins in E. coli. Microb Cell Fact. 12, 37 (2013).
- Sachdev, D., Chirgwin, J. M. Fusions to maltose-binding protein: control of folding and solubility in protein purification. Methods Enzymol. 326, 312-321 (2000).
- Smith, D. B. Generating fusions to glutathione S-transferase for protein studies. Methods Enzymol. 326, 254-270 (2000).
- de Marco, A., Deuerling, E., Mogk, A., Tomoyasu, T., Bukau, B. Chaperone-based procedure to increase yields of soluble recombinant proteins produced in E. coli. BMC Biotechnol. 7, 32 (2007).
- Hatahet, F., Nguyen, V. D., Salo, K. E., Ruddock, L. W. Disruption of reducing pathways is not essential for efficient disulfide bond formation in the cytoplasm of E. coli. Microb Cell Fact. 9, 67 (2010).
- de Marco, A. Recent contributions in the field of the recombinant expression of disulfide bonded proteins in bacteria. Microb Cell Fact. 11, 129 (2012).
- Katzen, F., Beckwith, J. Disulfide bond formation in periplasm of Escherichia coli. Methods Enzymol. 348, 54-66 (2002).
- Klint, J. K., et al. Production of recombinant disulfide-rich venom peptides for structural and functional analysis via expression in the periplasm of E. coli. PloS One. 8, e63865 (2013).
- Braud, S., et al. Dual expression system suitable for high-throughput fluorescence-based screening and production of soluble proteins. Journal of Proteome Research. 4, 2137-2147 (2005).
- Douzi, B. G. A., et al. A new system for expressing recombinant animal toxins in E. coli. (Collection Rencontres en Toxicologie, Publications de la SFET, Chatenay-Malabry). Advances and new technologies in toxinology. , 149-152 (2010).
- Groisillier, A., et al. MARINE-EXPRESS: taking advantage of high throughput cloning and expression strategies for the post-genomic analysis of marine organisms. Microb Cell Fact.. 9, 45 (2010).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55, 65-72 .
- Xiao, R., et al. The high-throughput protein sample production platform of the Northeast Structural Genomics Consortium. Journal of Structural Biology. 172, 21-33 (2010).
- Saez, N. J., Vincentelli, R., Chen, Y. W. Ch3 High-throughput expression screening and purification of recombinant proteins in E. coli. Structural Genomics: General Applications : Methods in Molecular Biology. 1091, 33-53 (2014).
- Katzen, F. Gateway (R) recombinational cloning: a biological operating system. Expert. Opin. Drug Discov. 2, 571-589 (2007).
- Vincentelli, R., Canaan, S., Offant, J., Cambillau, C., Bignon, C. Automated expression and solubility screening of His-tagged proteins in 96-well format. Analytical Biochemistry. 346, 77-84 (2005).
- Studier, F. W. Protein production by auto-induction in high density shaking cultures. Protein Expr Purif. 41, 207-234 (2005).
- Spencer, C. I., et al. Ion channel pharmacology under flow: automation via well-plate microfluidics. Assay Drug Dev Technol. 10, 313-324 (2012).
- Sala, E., de Marco, A. Screening optimized protein purification protocols by coupling small-scale expression and mini-size exclusion chromatography. Protein Expr Purif. 74, 231-235 (2010).
- Moon, A. F., Mueller, G. A., Zhong, X., Pedersen, L. C. A synergistic approach to protein crystallization: combination of a fixed-arm carrier with surface entropy reduction. Protein science: a publication of the Protein Society. 19, 901-913 (2010).
- Zanier, K., et al. . Structural basis for hijacking of cellular LxxLL motifs by papillomavirus E6 oncoproteins. 339, 694-698 (2013).
- Kapust, R. B., Tozser, J., Copeland, T. D., Waugh, D. S. The P1′ specificity of tobacco etch virus protease. Biochemical and Biophysical Research Communications. 294, 949-955 (2002).
- Vincentelli, R., Romier, C. Expression in Escherichia coli: becoming faster and more complex. Current Opinion in Structural Biology. 23, 326-334 (2013).
- Jolma, A., et al. DNA-binding specificities of human transcription factors. Cell. 152, 327-339 (2013).
- Aslanidis, C., de Jong, P. J. Ligation-independent cloning of PCR products (LIC-PCR). Nucleic Acids Research. 18, 6069-6074 (1990).
- Haun, R. S., Serventi, I. M., Moss, J. Rapid, reliable ligation-independent cloning of PCR products using modified plasmid vectors. BioTechniques. 13, 515-518 (1992).
- van den Ent, F., Lowe, J. RF cloning: a restriction-free method for inserting target genes into plasmids. Journal of Biochemical and Biophysical Methods. 67, 67-74 (2006).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput automated refolding screening of inclusion bodies. Protein science: a publication of the Protein Society. 13, 2782-2792 (2004).
