Förekomsten av högrisk-HPV i huvud och hals tumörvävnad är förknippad med gynnsamma resultat. Den nyutvecklade RNA in situ hybridisering teknik som kallas RNAscope möjliggör direkt visualisering av HPV E6/E7 mRNA i FFPE vävnadssnitt.
Den "gyllene standard" för onkogena HPV-detektion är demonstration av transkriptionellt aktiva högrisk-HPV i tumörvävnad. Men upptäckt av E6/E7 mRNA genom kvantitativ omvänd transkription polymeraskedjereaktion (QRT-PCR) kräver RNA-extraktion som förstör tumörvävnad sammanhang avgörande för morfologisk korrelation och har varit svår att antas i klinisk vardag. Vår nyutvecklade RNA in situ hybridisering teknik, RNAscope, medger direkt visualisering av RNA i formalinfixerade, paraffininbäddade (FFPE) vävnader med enda molekyl känslighet och enda cell upplösning, vilket möjliggör mycket känslig och specifik in situ-analys av varje RNA biomarkör i rutinmässiga kliniska prover. Den RNAscope HPV-analysen var utformad för att upptäcka E6/E7 mRNA av sju högrisk-HPV-genotyper (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 och 58) med hjälp av en pool av genotyp-specifika prober. Det har visat utmärkt känslighetoch specificitet mot den nuvarande "gyllene standard" metod för att upptäcka E6/E7 mRNA genom QRT-PCR. HPV-status bestäms av RNAscope är starkt prognostisk av kliniskt resultat i svalg cancerpatienter.
Högrisk humant papillomvirus (HR-HPV) infektion utgör cirka 5% av all cancer i världen 1. Förekomsten av HPV-associerad orofaryngeal cancer har ökat under de senaste decennierna, särskilt bland män. HPV-positiv orofaryngeal skivepitelcancer (OPSCC) kommer sannolikt att utgöra en majoritet av alla huvud-halscancer i USA under de kommande 20 åren 2. Orofaryngeal skivepitelcancer som orsakas av HPV är förknippade med god överlevnad och tumör HPV-status är en stark och oberoende prognostisk faktor för överlevnad 3.
Bevis för transkriptionsaktivering av de virala onkogener E6 och E7 anses vara den gyllene standarden för förekomsten av kliniskt relevanta HPV-4. Dock är detektion av E6/E7 mRNA från färsk tumörvävnad med RT-PCR-teknik inte praktiskt i rutinmässig klinisk praxis och har begränsats till forskningslaboratorier. Nyligen, vi have utvecklat en ny RNA ISH teknik som kallas RNAscope, vilket gör att multiplex detektion i enskilda celler med enkel RNA-molekyl känslighet i formalinfixerad paraffininbäddade vävnadsprover (FFPE) 5-10. Vi gav tre rader av bevis för enda molekyl upptäckt 5. För det första, det RNAscope sonden design och signalamplifieringssystem tillåten upptäckt av enstaka exemplar HER2 iska DNA-mål i HeLa-och SK-BR-3-cellinjer. För det andra, när de jämförs med HER2-genomiska DNA-signaler, fördelningen av de fluorescerande intensiteter av HER2-mRNA-signal prickar i HeLa-celler som var i överensstämmelse med en molekyl per punkt. För det tredje, antalet HER2 mRNA signal punkter per cell matchas noga HER2 mRNA kopieantal uppskattades av en lösning baserad kvantifiering analys, ytterligare stöder enda molekyl upptäckt. Dessutom motfärgning av kärnor med DAPI i fluorescensmikroskopi eller med hematoxylin i ljusfält mikroskopi tillåter visualisering av individuella kärnor, WHich i sin tur möjliggör detektion och kvantifiering av RNA-mål på enkelcellbasis 10. Förmågan att analysera genuttryck på plats i rutinmässiga kliniska prover gör RNAscope en lovande plattform för diagnostisk patologi, speciellt de FFPE vävnadssektionsbaserade analyser 10,11. Vi har utvecklat ett RNAscope-baserad HPV-analys för att detektera E6/E7 mRNA av sju högrisk HPV-genotyper (HPV16, 18, 31, 33, 35, 52 och 58) med hjälp av en pool av genotyp-specifika prober. Våra senare studier i OPSCC har visat att RNAscope HPV-analysen är mycket känslig och specifik för att bestämma HPV-status på FFPE vävnader 12-17, och också informerar prognos i OPSCC 12,16.
Principen för RNAscope teknologi har tidigare beskrivits 5. Här beskriver vi den kompletta RNAscope analysprotokollet och visa sin användning vid detektion av HR-HPV i FFPE tumörvävnadssnitt.
Den RNAscope HPV-analysen får direkt visualisering av E6/E7 mRNA in situ i HPV-associerad huvud och hals skivepitelcancer. Den RNAscope analysen är helt kompatibel med rutinmässigt fixerad tumörvävnad och bevarar vävnadsmorfologi för histopatologiska korrelationer (Figur 2). En viktig fördel med RNAscope analysen över konventionella CISH metoder är att det uttryckligen förstärker hybridiseringssignalerna (figur 2B och 2E) utan att förstärka bakgrundsljud (figur 2C och 2F).
I praktiken kan det RNAscope HPV-analysproceduren avslutas inom 8 h eller bekvämt uppdelad över två dagar. Den RNAscope HPV-analysen har använts för att bestämma HPV status i huvud och hals skivepitelcancer 12-16, visar 97% sensitivitet och 93% specificitet med hjälp av QRT-PCR som referensmetod 16. Konventionell chromogenic ISH för HR-HPV-DNA är höggradigt specifik men har en känslighet av ~ 80% 12. Immunhistokemisk (IHC) färgning för den cellulära surrogatmarkör p16 visar utmärkt känslighet men kan ge falskt positiva resultat 15,18, särskilt i nonoropharyngeal huvud-halscancer 15. Den nuvarande "gyllene standard" metod för QRT-PCR för HPV E6/E7 mRNA detektion kräver fryst vävnad för optimala resultat och är tekniskt komplicerat, vilket begränsar dess användning till forskningen enda laboratorium. Dessutom kräver det RNA-extraktion som gör det omöjligt att korre HR-HPV E6/E7 mRNA-expression med histopatologi.
Det finns flera kritiska faktorer för framgången av RNAscope assay. Först, för bästa resultat, vävnader bör fastställas i färska 10% neutral buffrad formalin vid rumstemperatur i 16-32 timmar enligt riktlinjer ASCO / CAP 19. För det andra är HybEZ ugnen rekommenderas eftersom det gör det möjligts optimal kontroll av temperatur och fuktighet för probhybridisering och signalförstärkning steg. För det tredje är det viktigt att avlägsna överskott av rest buffertar före varje steg, men ändå hålla vävnadssnittet från att torka under någon av dessa steg.
Den manuella RNAscope förfarande som beskrivs här är helt automatiserad kommersiell slide automatisk färgning systemet 10. Detta skulle i hög grad underlätta standardisering av analysförhållanden och sparar värdefull kroppsarbete i klinisk patologi laboratorier. Dessutom har dedikerade bildanalys programvara utvecklats 10 för att automatiskt identifiera celler och färgsignaler på en digitaliserad bild, vilket bör bidra till att eliminera subjektivitet och förbättra reproducerbarhet i att göra poäng.
Sammanfattningsvis detekterar RNAscope HPV-analysen närvaron av HR-HPV E6/E7 mRNA-transkript in situ i FFPE vävnader. Den har ett arbetsflöde som är bekant för klinisk patologi laboratorier genom att tillåta direkt visualisering av dessa i vävnadssektioner. Den erbjuder en perfekt plattform för att pröva (FFPE) vävnadsprover, och kan lätt antas av diagnostiska patologilaboratorier.
The authors have nothing to disclose.
Stöds delvis av NIH bidrag (R43/44CA122444) och DOD BRCP bidrag (W81XWH-06-1-0682) till YL.
SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit – Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
Cover Glass 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
Drying Oven | Capable of holding temperature at 60 ± 1°C | ||
Water Bath | Capable of holding temperature at 40 ± 1°C | ||