Için RNAscope<em> In situ</em> Head transkriptional Aktif Human Papilloma Virüs Tespiti ve Boyun Skuamöz Hücre Karsinomu
Summary
Baş ve boyun tümör dokusunda yüksek riskli HPV varlığı olumlu sonuçlar ile ilişkilidir. RNAscope denilen in situ hibridizasyon tekniği son zamanlarda geliştirilen RNA FFPE doku kesitlerinde HPV E6/E7 mRNA doğrudan görselleştirme sağlar.
Abstract
Onkojenik HPV tespiti için 'altın standart' tümör dokusunda transkripsiyonel aktif yüksek riskli HPV gösteri. Bununla birlikte, sayısal ters transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (qRT-PCR) ile E6/E7 mRNA'nın tespiti morfolojik korelasyon için tümör dokusu bağlam kritik yok eder ve rutin klinik pratikte kabul edilmesi zor olmuştur RNA ekstraksiyonu gerektirir. In situ melezleme teknolojisi RNAscope bizim yeni geliştirilmiş bir RNA, tek bir molekül duyarlılık ve herhangi bir biyomarker RNA in situ analizi, son derece hassas ve spesifik sağlayan tek bir hücre çözünürlük, formalinle sabitlenmiş, parafine gömülmüş (FFPE) dokuda RNA doğrudan görselleştirme izin verir rutin klinik örneklerde. RNAscope HPV deney genotip özgü problar bir havuz kullanılarak E6/E7 yedi yüksek riskli HPV genotiplerinin mRNA'nın (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, ve 58) tespit etmek için tasarlanmıştır. Bu mükemmel hassasiyet göstermiştirve Mah-PCR ile E6/E7 mRNA tespit geçerli 'altın standart' yöntemiyle karşı seçicilik. RNAscope tarafından belirlenen HPV durumu orofaringeal kanser hastalarında klinik sonucun güçlü prognostik olduğunu.
Introduction
Dünya çapında 1 tüm kanserlerin yaklaşık% 5 için yüksek riskli insan papilloma virüsü (HR-HPV) enfeksiyonu hesaplar. HPV-ilişkili orofarengeal kanser insidansı, özellikle erkekler arasında, son yıllarda artmıştır. HPV-pozitif orofaringeal skuamöz hücreli karsinom (OPSCC) muhtemelen önümüzdeki 20 yılda 2 Amerika Birleşik Devletleri'nde tüm baş ve boyun kanserlerinin çoğunluğu teşkil edecektir. HPV neden Orofarengeal skuamöz hücreli karsinom olumlu sağkalım ile ilişkili, ve tümör HPV durum hayatta kalma 3 için güçlü ve bağımsız bir prognostik faktör olduğunu vardır.
Viral onkojenler E6 ve E7 transkripsiyonel aktivasyonu için kanıt klinik olarak ilgili HPV 4 varlığı için altın standardı olarak düşünülmektedir. Bununla birlikte, RT-PCR tekniği ile taze tümör dokusundan E6/E7 mRNA'nın tespiti rutin klinik uygulamada pratik değildir ve araştırma laboratuarlarında ile sınırlı olmuştur. Son zamanlarda, biz havE formalin fikse parafine gömülü doku örneklerinden (FFPE) 5-10 tek RNA molekülü duyarlılık ile bireysel hücrelerin multipleks algılamayı sağlayan RNAscope adında yeni bir RNA ISH teknolojisini geliştirdi. Biz tek bir molekül tespiti 5 delil üç satır sağladı. İlk olarak, RNAscope prob tasarımı ve sinyal yükseltme sistemi HeLa ve SK-BR-3 hücre hatlarında tek kopya HER2 genomik DNA hedeflerinin tespiti izin verdi. HER2 genomik DNA sinyalleri ile karşılaştırıldığında İkincisi, HeLa hücrelerinde mRNA HER2 sinyal noktaların floresan yoğunluklarının dağıtım nokta başına bir molekülü ile tutarlıdır. Üçüncü olarak, hücre başına HER2 mRNA sinyali noktaların sayısı daha tek bir molekülün tespitini destekleyen, yakından bir çözüm-tabanlı ölçüm testiyle tahmin HER2 mRNA kopya sayısını eşleşti. Ayrıca, floresan mikroskopi veya aydınlık alan mikroskobu hematoksilen ile DAPI ile çekirdeklerin counterstaining WH, bireysel çekirdeklerin görselleştirme sağlarich da bir tek hücre bazında 10 tespiti ve RNA hedeflerin ölçümü sağlar. Rutin klinik örneklerinde in situ gen ifadesini analiz yeteneği, özellikle de FFPE doku bölümünde dayalı tahliller 10,11, RNAscope tanısal patoloji için umut verici bir platform yapar. Bu genotip özgü sondaların bir havuzu kullanılarak yedi yüksek riskli HPV genotipi (HPV 16, 18, 31, 33, 35, 52, ve 58) bir E6/E7 mRNA'yı tespit etmek için bir RNAscope tabanlı bir HPV analiz geliştirdik. OPSCC Bizim son çalışmalar RNAscope HPV tahlil FFPE dokularda 12-17 HPV statüsünün belirlenmesinde son derece duyarlı ve özgül olduğunu ve aynı zamanda OPSCC 12,16 prognozu bilgilendirir göstermiştir.
RNAscope teknolojinin ilkesi, daha önce 5 tarif edilmiştir. Burada, tam RNAscope deney protokolü tarif ve FFPE tümör doku kesitlerinde in HR-HPV saptanmasında kullanımını göstermektedir.
Protocol
Representative Results
Discussion
RNAscope HPV tahlil HPV-ilişkili baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom in situ E6/E7 mRNA doğrudan görselleştirme izin verdi. RNAscope tahlil rutin sabit tümör dokusu ile tamamen uyumludur ve histopatolojik korelasyon için doku morfolojisi (Şekil 2) korur. Geleneksel yöntemlere göre CISH RNAscope deneyinin önemli bir avantajı, özel olarak arka plan gürültüsünü (Şekiller 2C ve 2F) amplifiye olmayan hibridizasyon sinyalleri (Şekil 2B ve 2E) kuvvetlendirir olmasıdır.
Uygulamada, RNAscope HPV deney prosedürü 8 saat içinde tamamlanabilir ya da uygun bir iki gün boyunca bölünmüş. RNAscope HPV tahlil referans yöntem olarak 16 Mah-PCR kullanarak% 97 duyarlılık ve% 93 özgüllük göstererek, baş ve boyun skuamöz hücreli karsinom 12-16 HPV durumunu belirlemek için kullanılır olmuştur. Konvansiyonel chrHR-HPV DNA omogenic ISH yüksek düzeyde spesifik olduğunu fakat% 80 ~ 12 bir hassasiyete sahiptir. Hücresel vekil işaretleyici p16 immünhistokimyasal (İHK) boyama mükemmel hassasiyet gösterir ama özellikle nonoropharyngeal baş ve boyun kanserlerinde 15 yanlış pozitif sonuçlar 15,18 oluşturabilir. HPV E6/E7 mRNA tespiti için Mah-PCR mevcut "altın standart" yöntem, yalnızca araştırma laboratuvarında kendi kullanımını sınırlar, en iyi sonuçlar için taze dondurulmuş doku gerektirir ve teknik olarak karmaşık. Buna ek olarak, bu imkansız histopatoloji ile HR-HPV E6/E7 mRNA ifadesini ilişkili kolaylaştırır RNA ekstraksiyonu gerektirir.
RNAscope tahlil başarısı için çok önemli bir faktör vardır. İlk olarak, en iyi sonuçlar için, dokular ASCO / CAP kılavuzlar 19 göre 16-32 saat boyunca oda sıcaklığında, taze,% 10 nötr tamponlu formalin içine sabitlenmiş olmalıdır. O etkinleştirmek beri İkincisi, HybEZ fırın tavsiye edilirprob hibridizasyon ve sinyal amplifikasyon adımlar için sıcaklık ve nem kontrol optimal s. Üçüncü olarak, her adımda daha önce fazla kalıntı tamponlar çıkaracaklardır, fakat yine de bu adımların sırasında herhangi bir kurutma bölümü doku tutmak önemlidir.
Burada anlatılan manuel RNAscope prosedür tamamen ticari bir slayt oto boyama sisteminde 10 otomatik olmuştur. Bu büyük ölçüde deney koşulları ve klinik patoloji laboratuvarlarında tasarrufu değerli el emeği standardizasyon kolaylaştırmak gerekir. Buna ek olarak, özel bir görüntü analiz yazılımı otomatik olarak öznelliği ortadan kaldırmak ve puanlama üretilebilirliğe geliştirmek için yardımcı olmalıdır dijitalize slayt üzerinde hücreleri ve boyama sinyalleri belirlemek için 10 geliştirilmiştir.
Özet olarak, RNAscope HPV deney FFPE dokularda in situ HR-HPV E6/E7 mRNA varlığını algılar. Klinik patoloji laborant tanıdık bir iş akışı vardoku bölümlerinde bu doğrudan görselleştirme izin vererek Tories. Bu (FFPE) doku örneklerini inceleyerek için ideal bir platform sunuyor ve kolayca teşhis patoloji laboratuarları tarafından kabul edilebilir.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
YL NIH hibe (R43/44CA122444) ve DOD BRCP hibe (W81XWH-06-1-0682) tarafından kısmen destekleniyor.
Materials
| SuperFrost Plus slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| HybEZ Oven, Tray, and Rack | Advanced Cell Diagnostics | 310011, 310012, 310014 | |
| RNAscope 2.0 FFPE Reagent Kit – Brown | Advanced Cell Diagnostics | 310035 | |
| RNAscope HPV-HR7 Probe for HPV 16,18,31,33,35,52 and 58, E6/E7 mRNA | Advanced Cell Diagnostics | 312351 | |
| ImmEdge Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratory | H-4000 | |
| 100% EtOH | American Master Tech Scientific | ALREAGAL | |
| Xylene | Fisher Scientific | X3P-1GAL | |
| Gill’s Hematoxylin I | American Master Tech Scientific | HXGHE1LT | |
| Ammonia hydroxide | Sigma-Aldrich | 320145-500mL | |
| Cover Glass 24×50 mm | Fisher Scientific | 12-545-F | |
| Hot Plate | Fisher Scientific | 11-300-49SHP | |
| Drying Oven | Capable of holding temperature at 60 ± 1°C | ||
| Water Bath | Capable of holding temperature at 40 ± 1°C | ||
References
- Parkin, D. M. The global health burden of infection-associated cancers in the year 2002. Int. J. Cancer. 118 (12), 3030-3044 (2006).
- Chaturvedi, A. K., et al. Human papillomavirus and rising oropharyngeal cancer incidence in the United States. J. Clin. Oncol. 29 (32), 4294-4301 (2011).
- Ang, K. K., et al. Human papillomavirus and survival of patients with oropharyngeal cancer. N. Engl. J. Med. 363 (1), 24-35 (2010).
- Smeets, S. J., et al. A novel algorithm for reliable detection of human papillomavirus in paraffin embedded head and neck cancer specimen. Int. J. Cancer. 121 (11), 2465-2472 (2007).
- Wang, F., et al. RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues. J. Mol. Diagn. 14 (1), 22-29 (2012).
- Liu, X., et al. Specific regulation of NRG1 isoform expression by neuronal activity. J. Neurosci. 31 (23), 8491-8501 (2011).
- Yan, K. S., et al. The intestinal stem cell markers Bmi1 and Lgr5 identify two functionally distinct populations. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (2), 466-471 (2012).
- Payne, R. E., et al. Viable circulating tumour cell detection using multiplex RNA in situ hybridisation predicts progression-free survival in metastatic breast cancer patients. Br. J. Cancer. 106 (11), 1790-1797 (2012).
- Bordeaux, J. M., et al. Quantitative in situ measurement of estrogen receptor mRNA predicts response to tamoxifen. PLoS One. 7 (5), (2012).
- Wang, Z., et al. Automated quantitative RNA in situ hybridization for resolution of equivocal and heterogeneous ERBB2 (HER2) status in invasive breast carcinoma. J. Mol. Diagn. 15 (2), 210-219 (2013).
- Tubbs, R. R., et al. Ultrasensitive RNA in situ Hybridization for Detection of Restricted Clonal Expression of Low Abundance Immunoglobulin Light Chain mRNA in B-Cell Lymphoproliferative Disorders. Am. J. Surg. Pathol. In press, (2013).
- Ukpo, O. C., Flanagan, J. J., Ma, X. J., Luo, Y., Thorstad, W. L., Lewis, J. S. High-risk human papillomavirus E6/E7 mRNA detection by a novel in situ hybridization assay strongly correlates with p16 expression and patient outcomes in oropharyngeal squamous cell carcinoma. Am. J. Surg. Pathol. 35 (9), 1343-1350 (2011).
- Lewis, J. S., et al. Transcriptionally-active high-risk human papillomavirus is rare in oral cavity and laryngeal/hypopharyngeal squamous cell carcinomas–a tissue microarray study utilizing E6/E7 mRNA in situ hybridization. Histopathology. 60 (6), 982-991 (2012).
- Lewis, J. S., et al. Partial p16 staining in oropharyngeal squamous cell carcinoma: extent and pattern correlate with human papillomavirus RNA status. Mod. Pathol. 25 (9), 1212-1220 (2012).
- Bishop, J. A., et al. Detection of transcriptionally active high-risk HPV in patients with head and neck squamous cell carcinoma as visualized by a novel E6/E7 mRNA in situ hybridization method. Am. J. Surg. Pathol. 36 (12), 1874-1882 (2012).
- Schache AG, ., et al. Validation of a novel diagnostic standard in HPV-positive oropharyngeal squamous cell carcinoma. Br. J. Cancer. 108 (6), 1332-1339 (2013).
- Mehrad, M., et al. Papillary Squamous Cell Carcinoma of the Head and Neck: Clinicopathologic and Molecular Features With Special Reference to Human Papillomavirus. Am. J. Surg. Pathol. Jun. , (2013).
- Jordan, R. C., et al. Validation of methods for oropharyngeal cancer HPV status determination in US cooperative group trials. Am. J. Surg. Pathol. 36, 945-954 (2012).
- Hammond, M. E., et al. American Society of Clinical Oncology/College of American Pathologists guideline recommendations for immunohistochemical testing of estrogen and progesterone receptors in breast cancer (unabridged version). Arch. Pathol. Lab. Med. 134 (7), 48-72 (2010).
