הדמיה ברזולוציה סופר של שלפוחית צפופות ליבות עצבית
Summary
אנו מתארים כיצד ליישם מיקרוסקופיה לוקליזציה photoactivated (PALM) מבוסס מחקרים של שלפוחית בנוירונים קבוע, בתרבית. רכיבי מפתח של הפרוטוקול שלנו כוללים שלפוחית תיוג עם מפלצות photoconvertible, איסוף תמונות גולמיות נדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי לייצר תמונה ברזולוציה סופר.
Abstract
זיהוי של הקרינה מספק את הבסיס לשיטות מיקרוסקופיה רבות מנוצלים באופן נרחב ומתקדמות במהירות המועסקות ביישומים ביולוגיים ורפואיים מודרניים. עוצמות של הקרינה כוללות את הרגישות שלו, סגוליות, ותאימות עם הדמיה לחיות. למרבה הצער, צורות מקובלות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי סובלות מחולשה, ברזולוציה אחת גדולה עקיפה מוגבלת במטוס ההדמיה, אשר פוגעת לימודים של מבנים עם ממדים קטנים יותר ~ 250 ננומטר. לאחרונה, מגבלה זו כבר להתגבר עם ההקדמה של טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רזולוציה סופר, כגון מיקרוסקופיה photoactivated הלוקליזציה (PALM). שלא כמו עמיתיהם קונבנציונליים שלה, PALM יכול להפיק תמונות ברזולוציה רוחב של עשרות ננומטרים. זה ובכך ניתן כיום להשתמש בקרינה, עם העוצמות עצום שלו, על מנת להבהיר ספקטרום של תכונות נגישים בעבר של מבנה וארגון תאיים.
_content "> לרוע המזל, PALM הוא לא טריוויאלי ליישם, ואסטרטגיות מוצלחות לעתים קרובות חייבת להיות מותאם לסוג המערכת תחת מחקר. במאמר זה, אנו מראים כיצד ליישם מחקרי PALM יחיד צבע של מבנים בועי בנוירונים קבועים, בתרבית. PALM הוא אידיאלי למחקר של שלפוחית, אשר יש ממדים, כי בדרך כלל נעים בין ~ 50-250 ננומטר. צעדי מפתח בגישה שלנו כוללים תיוג נוירונים עם photoconvertible (מירוק לאדום) מפלצות מטענים שלפוחית, איסוף תמונות גולמיות שנדגמו בדלילות עם מערכת מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר, ועיבוד התמונות גולמיות כדי להפיק תמונת PALM ברזולוציה גבוהה. אנחנו גם להדגים את היעילות של הגישה שלנו על ידי הצגת תמונות יוצאת דופן נפתרו היטב של שלפוחית צפופות ליבות (DCVs) בנוירונים בהיפוקמפוס בתרבית, שלהפריך את ההשערה כי סחר extrasynaptic של DCVs מתווך בעיקר על ידי אשכולות DCV.Introduction
מספר התהליכים התאיים תלוי בסחר בתיווך שלפוחית מדויק ויעיל של ביומולקולות ליעדי subcellular ספציפיים. דוגמא בולטת אחת היא הרכבה הסינפטי, אשר קדמה משלוח נע ארוך, בתיווך שלפוחית של מרכיבים הסינפטי מאתרים של קיום חיים בסומה העצבית לאתרים מראש וpostsynaptic פוטנציאל דיסטלי 1.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא שיטה חזקה והפופולרית של לימוד סחר בשלפוחית. נקודות חוזק של הטכניקה כוללות את הרגישות שלו, סגוליות, ותאימות עם הדמיה לחיות 2. למרבה הצער, עד יחסית לאחרונה, הטכניקה סבלה מחולשה אחת גדולה, ברזולוציה מוגבלת דיפרקציה 2, דבר המקשה מחקרים של מבנים עם ממדים קטנים יותר ~ 250 ננומטר. לאחרונה, ברזולוציה רוחב במיקרוסקופ פלואורסצנטי עלתה המחסום העקיפה עם ההקדמה של מיל הקרינה רזולוציה סופרטכניקות croscopy, כגון PALM 3. ברזולוציה הרוחב של PALM, עשרות ננומטרים, היא אידיאלית למחקר של שלפוחית, אשר יש ממדים שבדרך כלל נעים בין 50-250 ננומטר ~ 4. זה ובכך ניתן כיום להשתמש בקרינה, עם העוצמות עצום שלו, על מנת להבהיר ספקטרום של תכונות נגישים בעבר של שלפוחית, כוללים כמה היבטים של הסחר שלהם לאתרי subcellular ספציפיים.
PALM הוא לא טריוויאלי ליישם, ואסטרטגיות מוצלחות לעתים קרובות חייבת להיות מותאמים לסוג המערכת תחת מחקר. כאן אנו מתארים כיצד ליישם מחקרי PALM של מבני ועי, ואנחנו מדגימים את היעילות של הגישה שלנו למקרה של DCVs בנוירונים בהיפוקמפוס. בפרט, אנו משתמשים PALM להתייחס להשערה כי הסחר של DCVs לסינפסות בנוירונים בהיפוקמפוס מתווך על ידי אשכולות DCV 5-8.
סחר בתיווך Cluster של שלפוחית לסינפסות בפיתוח neurons היא אפשרות מעניינת, כי זה עשוי להקל על ייצוב הסינפטי מהיר והרכבה 9,10. חסידי סחר באשכולות של DCVs לצטט את הגודל נראים הגדול של puncta ניאון extrasynaptic מחסה מטען DCV אקסוגני כראיות התומכות באשכולות 6. עם זאת, puncta אלה מופיעים בתמונות שנוצרו תוך שימוש בטכניקות עקיפה מוגבל הקרינה מיקרוסקופית, שאינם מתאימות לגודל אפקטים ייחודיים הנובעים מעקיפה מאלה הנובעים מאשכולות.
כדי לפתור בעיה זו, אספנו הקרינה widefield קונבנציונלית ותמונות PALM של נוירונים בהיפוקמפוס להביע מפלצות ממוקדות לDCVs. ניתוח של התמונות הללו נחשף כי> 92% מאשכולות DCV extrasynaptic המשוערת בתמונות קונבנציונליות נפתרים כ80 ננומטר puncta 11 (פרט DCV בגודל) בתמונות PALM. לפיכך, נתונים אלה במידה רבה לפסול את השערת האשכולות כפי שהוחל על DCVs בפיתוח hippocaנוירונים mpal.
Protocol
Representative Results
Discussion
PALM ושיטות מיקרוסקופיה קשורות רזולוציה סופר הקרינה צמחו לאחרונה כהשלמה חשובה לצורות מבוססות יותר של מיקרוסקופיה אופטית ומיקרוסקופי אלקטרונים (EM) 22-24. תכונות חיוביות של PALM כוללות הכנת מדגם פשוט יחסית והפרעות מדגם מינימליות. באופן עקרוני, PALM גם יכול לשמש כדי לחקו…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות מענקי R15 2 GM061539-02 (לBAS), 2 R15 NS40425-03 (לjel), MH 66,179 (לד"ר גארי בנקר של אורגון לבריאות ומדע באוניברסיטה / OHSU), וP30 NS061800 (ד"ר סו Aicher של OHSU). אנו מודים לברברה Smoody לתמיכה נרחבת בתרבות של תאי עצב בהיפוקמפוס, ובני זוג. בריאן ארוך וג'יימס Abney לקריאה ביקורתית של כתב היד הזה.
Materials
| Zeiss PALM | Carl Zeiss, Inc. | Elyra PS.1 | With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633 |
| Lipofectamine 2000 Transfection Reagent | Life Technoligies | 11668-019 | |
| Minimum Essential Medium | Life Technologies | 11095-080 | |
| Phosphate-Buffered Saline | Life Technologies | 10010049 | |
| Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 19208 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S-8501 | |
| growth glass coverslips 18mm 1.5D | Fisher Scientific | NC0059095 |
References
- Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components. Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).
- Combs, C. A. Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods. Curr Protoc Neurosci. , (2010).
- Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging. Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).
- Alberts, B., et al. . Molecular Biology of the Cell. , (2007).
- Bury, L. A., Sabo, S. L. Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation. Neural Dev. 6, 24 (2011).
- Matsuda, N., et al. Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite. J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).
- Tao-Cheng, J. H. Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate. Neuroscience. 150, 575-584 (2007).
- Zhai, R. G., et al. Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle. Neuron. 29, 131-143 (2001).
- Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets. Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).
- Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis. Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).
- Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons. J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).
- Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement. Biotechniques. 42, (2007).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Scalettar, B. A., et al. Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking. Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).
- Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. Putting super-resolution fluorescence microscopy to work. Nat Methods. 6, 21-23 (2009).
- Helander, K. G. Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation. Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).
- Axelrod, D. Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology. Traffic. 2, 764-774 (2001).
- Toomre, D. Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems. Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).
- Shannon, C. Communication in the presence of noise. Proc IRE. 37, 10-21 (1949).
- Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy. Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).
- Sengupta, P., et al. Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis. Nat Methods. 8, 969-975 (2011).
- Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313, 1642-1645 (2006).
- Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. A guide to super-resolution fluorescence microscopy. J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).
- Zhong, H. Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution. Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).
- Lochner, J. E., et al. Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity. Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).
- Geisler, C., et al. Drift estimation for single marker switching based imaging schemes. Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).
