Super-résolution d'imagerie de neurones vésicules à cœur dense

Un certain nombre de processus cellulaires dépendent de trafic précis et efficace des vésicules médiée par des biomolécules sous-cellulaires à des destinations spécifiques. Un exemple frappant est l'assemblage synaptique, qui est précédé par une longue-distance, la livraison des vésicules synaptiques à médiation des constituants à partir de sites de la biogenèse du soma neuronal de sites pré-et post-synaptiques potentiellement distales ^1.

La microscopie à fluorescence est une méthode puissante et populaire d'étudier le trafic vésiculaire. Points forts de la technique sont sa sensibilité, la spécificité, et la compatibilité avec l'imagerie en direct ^2. Malheureusement, jusqu'à relativement récemment, la technique a souffert d'une faiblesse majeure, la résolution limitée par la diffraction ^2, ce qui entrave les études de structures avec des dimensions inférieures à ~ 250 nm. Récemment, la résolution latérale en microscopie à fluorescence a dépassé la barrière de diffraction avec l'introduction de mi de fluorescence super-résolutiontechniques croscopy, tels que PALM ^3. La résolution latérale de PALM, des dizaines de nanomètres, est idéalement adapté à l'étude de vésicules, qui ont des dimensions qui vont généralement de ~ 50-250 nm ^4. Il est donc maintenant possible d'utiliser la fluorescence, avec ses forces multiples, pour élucider un spectre d'attributs précédemment inaccessibles de vésicules, y compris certains aspects de leur trafic vers les sites sous-cellulaires spécifiques.

PALM n'est pas trivial à mettre en œuvre, et des stratégies efficaces doit souvent être adapté au type de système à l'étude. Nous décrivons ici comment mettre en œuvre des études paume de structures vésiculaires, et nous démontrons l'efficacité de notre approche pour le cas de VJCs dans les neurones de l'hippocampe. En particulier, nous utilisons PALM à vérifier l'hypothèse que le trafic de VJCs de synapses dans les neurones de l'hippocampe est médiée par les pôles de DCV ^5-8.

trafic de cluster médiation de vésicules de synapses dans le développement de neurons est une possibilité intéressante, car elle peut faciliter la stabilisation synaptique rapide et assemblage ^9,10. Les partisans de la traite cluster de VJCs citent la taille apparente de puncta fluorescent extrasynaptique hébergement fret DCV exogène comme preuve à l'appui regroupement ^6. Toutefois, ces points lacrymaux apparaissent dans les images générées en utilisant des techniques de microscopie de fluorescence diffraction limitée, qui ne sont pas adaptés à des effets de taille marquantes émanant diffraction de ceux découlant de clustering.

Pour résoudre ce problème, nous avons recueilli de fluorescence à champ large classique et images paume de neurones de l'hippocampe exprimant des chimères ciblées à VJCs. L'analyse de ces images a révélé que> 92% de présumés groupes de DCV extrasynaptiques en images classiques sont résolus 80 nm (DCV taille individuelle) ¹¹ points lacrymaux en images PALM. Ainsi, ces données invalident largement l'hypothèse de regroupement tel qu'il est appliqué à l'élaboration VJCs hippocaneurones MPAL.