Utilisation d'un multiplexage Caspase test destiné à déterminer l'apoptose dans une cellule du modèle hypothalamique

Les régimes riches en acides gras saturés comme l'acide palmitique (PA) ont été associés à l'obésité et d'autres comorbidités, notamment les maladies cardiovasculaires et le diabète ^{1, 2.} On a également montré les régimes alimentaires riches en matières grasses d'augmenter le stress oxydatif, l'apoptose, et la dégénérescence des neurones de l'hypothalamus, un important régulateur de l'appétit et les dépenses énergétiques ^3-7. Comprendre le mécanisme par lequel l'exposition de régime riche en graisses induit dérèglement hypothalamique est donc important pour le développement de traitements pharmacologiques de l'obésité. Toutefois, les mécanismes cellulaires à travers lequel les graisses alimentaires affecte la fonction neuronale restent floues. Une meilleure compréhension de la façon dont les graisses tels que le PA peuvent déclencher l'apparition de voies apoptotiques hypothalamiques est une première étape nécessaire vers cet objectif. Le but de cet article est de décrire un test multiplex pour les tests in vitro de la réponse neuronale à l'exposition PA, développé pour une utilisation dans les études de hneurodégénérescence ypothalamic. Nous fournissons une description détaillée d'un 96 bien le format dosage multiplex in vitro pour mesurer la caspase 3/7 activité par nombre total de cellules dans une ligne différenciée immortalisé de souris adulte hypothalamique cellulaire (désigné A12) après défi oxydatif avec PA ^8.

En bref, la viabilité cellulaire est déterminée après l'épreuve PA via un test de resazurine base. Résazurine est un composé perméable de cellule qui subit une réduction enzymatique dans les cellules métaboliquement actives, un processus de pensée de se produire via les mitochondries ^9. Les cellules viables à convertir en continu résazurine résorufine, la production d'un signal fluorescent proportionnel au nombre de cellules viables. l'activité de la caspase-3/7 est ensuite analysée en utilisant un dosage basé lumogenic-DEVD. DEVD est une séquence d'acides aminés (Asp-Glu-Val-Asp) clivée par la caspase-3. Lorsque cette séquence est couplé à une substance lumogenic, lors d'une activation intracellulaire de la caspase-3/7 et le clivage subséquentDEVD de substrat, le produit luminescent est libéré. Cette réaction est proportionnelle à l'activité des caspases et, par conséquent à l'induction de l'apoptose. Comme les cellules mortes ne peuvent pas produire la caspase, la caspase-3/7 activité est par nature transitoire; donc l'analyse doit être effectué entre 30 min à 4 h après la provocation, en fonction de l'efficacité de stress cellulaire. La viabilité des cellules est inversement proportionnelle à l'activité de la caspase-3/7 et peut être utilisé pour déterminer les mécanismes de mort cellulaire. Par exemple, ce procédé a déjà été utilisé pour montrer que le prétraitement avec l'hormone peptidique orexine réduit l'apoptose dans les cellules hypothalamiques provoquées avec du peroxyde d'hydrogène, ce qui suggère que des mécanismes affectés par ce traitement sont importants dans la protection contre les dommages oxydatifs ^10. Il est important de noter que ces tests sont-line et le tissu cellulaire dépendante, car elles reposent sur l'activité mitochondriale de réduire les réactifs de dosage. Ce protocole a été optimisé pour l'hypothalamus de souris adulte (A12) des cellules; cependant,méthodes décrites peuvent être modifiées pour s'adapter dans le cadre de recherches similaires.

Essais de multiplexage d'une seule culture fournit ainsi un avantage sur la méthode traditionnelle de réaliser des dosages individuels pour plusieurs raisons. En plus d'économiser du temps, des échantillons de cellules, et les réactifs de culture, des essais de multiplexage peuvent également fournir des connaissances de la survie cellulaire et la mort, assurer des contrôles internes, et d'éliminer la nécessité d'expériences répétitives ^{11, 12.}

Méthodes alternatives se sont appuyés sur des taches ou ELISA occidentaux, qui sont des tests fiables, mais ils sont coûteux et fastidieux (1-2 jours), en particulier lors de l'utilisation d'un format de 96 puits. À l'exclusion du temps qu'il faut pour des cellules de culture pour le test de multiplexage, la durée totale est inférieure à 3 heures. Bien que ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec les cellules A12, il peut être modifié pour une utilisation dans d'autres modèles tout en gardant à l'esprit les facteurs qui peuvent influer sur l'intégrité de la cellule. Dissuaderminier, si ce protocole travailler pour une série d'expériences dépend du nombre d'échantillons ou de conditions expérimentales et sur des expériences en aval prévues.