שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס
Summary
מבחני זמנית יכולים לספק מידע מועיל למנגנונים תאיים בסיסיים ולמנוע בזבוז של חומרים כימיים וניסויים חוזרים מיותרים. אנו מתארים כאן assay פעילות זמנית caspase-3/7, תוך שימוש בשיטות ניאון ומבוסס זורח, כדי לקבוע כדאיות תא במודל ההיפותלמוס במבחנה הבאה אתגר חמצוני עם חומצה פלמיטית.
Abstract
היכולת זמנית מבחני במחקרים של מנגנונים תאיים מורכבים מבטלת את הצורך בניסויים חוזרים ונשנים, מספקת בקרות פנימיות, ומצמצמת בזבוז בעלויות וחומרים כימיים. כאן אנו מתארים אופטימיזציה של assay זמנית להעריך אפופטוזיס הבאים חומצה פלמיטית אתגר (PA) במודל ההיפותלמוס במבחנה, באמצעות שני ניאון וזורח מבוסס מבחני כדי למדוד ספירת תאי קיימא וcaspase-3/7 פעילות ב96 היטב פורמט צלחת microtiter. בעקבות אתגר הרשות הפלסטינית, תאי קיימא נקבעו על ידי assay ניאון מבוסס resazurin. Caspase-3/7 פעילות הייתה אז נקבע באמצעות מצע luminogenic, DEVD, ומנורמל למספר סלולרי. assay הריבוב זוהי טכניקה שימושית לקביעת שינוי בפעילות caspase הבאה גירוי אפופטוטיים, כגון אתגר חומצת שומן רווי. חומצת השומן הרווי הרשות יכולה להגדיל את לחץ חמצוני ההיפותלמוס ואפופטוזיס, המציין את פוטנציאל importaNCE של מבחני כגון זה שתואר כאן בחקר הקשר בין חומצות שומן רוויות ותפקוד עצבי.
Introduction
דיאטות עשירות בחומצות שומן רוויות, כגון חומצה פלמיטית (PA) נמצאו קשורות להשמנת יתר ומחלות רקע אחרים, כוללים מחלת סוכרת 1, 2 לב וכלי דם. דיאטות שומן גבוהה יש גם הוכחו כדי להגדיל את לחץ חמצוני, אפופטוזיס, וניוון עצבי בהיפותלמוס, רגולטור חשוב של תיאבון והאנרגיה ההוצאה 3-7. הבנת המנגנון שבאמצעותו חשיפת דיאטת שומן גבוה גורמת לחוסר ויסות ההיפותלמוס כן חשובה לפיתוח של טיפולים תרופתיים להשמנת יתר. עם זאת, המנגנונים התאיים שבאמצעותו שומן משפיע על תפקוד עצבי עדיין אינם ברורים. הבנה טובה יותר של איך שומנים כגון הרשות הפלסטינית עלולים לעורר התפרצות של מסלולים אפופטוטיים ההיפותלמוס היא צעד ראשון הכרחי לקראת מטרה זו. מטרת מאמר זה היא לתאר זמנית assay לבדיקות במבחנה של תגובה העצבית לחשיפה של הרשות הפלסטינית, שפותח עבור שימוש במחקרים של שעותניוון מוחיים ypothalamic. אנו מספקים תיאור מפורט של assay במבחנה 96 היטב תבנית זמנית למדידת caspase 3/7 פעילות למספר כולל של תאים בשורה מובחנת הונצחה עכבר המבוגר ההיפותלמוס תא (המיועדת A12) לאחר אתגר חמצוני עם הרשות הפלסטינית 8.
בקצרה, כדאיות תא נקבעת בעקבות אתגר הרשות הפלסטינית באמצעות assay resazurin מבוסס. Resazurin היא תרכובת חדירה תאים שעוברת הפחתה האנזימטית בתאים פעילים מטבולית, תהליך המחשבה להתרחש באמצעות המיטוכונדריה 9. תאי קיימא ברציפות להמיר resazurin לresorufin, הפקת אות ניאון פרופורציונלית למספר תאי קיימא. פעילות caspase-3/7 אז הוא ניתח באמצעות assay lumogenic מבוסס DEVD. DEVD הוא רצף חומצות אמינו (ASP-Glu-Val-ASP) ביקע ידי caspase-3. כאשר רצף זה הוא מצמידים את חומר lumogenic, עם הפעלה של caspase-3/7 תאיים ומחשוף שלאחר מכןשל מצע DEVD, המוצר זורח הוא שוחרר. תגובה זו היא מידתית לפעילות caspase ובכך לאינדוקציה של אפופטוזיס. ככל שתאים מתים לא יכולים לייצר caspase, caspase-3/7 פעילות היא על ידי חולף טבע; לכן ניתוח אמור להסתיים בין 30 דקות עד 4 שעות לאחר אתגר, תלוי באפקטיבי של לחץ בתא. כדאיות תא עומד ביחס הפוך לפעילות caspase-3/7 והוא יכול לשמש כדי לקבוע מנגנונים של מוות של תאים. לדוגמא, בשיטה זו יש בעבר נהגה להראות טיפול מקדים שעם הורמון פפטיד orexin מפחית אפופטוזיס בתאי ההיפותלמוס תיגר עם מי חמצן, מה שמרמז כי המנגנונים מושפעים מטיפול זה הם חשובים בהגנה מפני נזק חמצוני 10. חשוב לציין, מבחני אלה הם תא קו ורקמות תלויות, כפי שהם סומכים על פעילות המיטוכונדריה להפחית ריאגנטים assay. פרוטוקול זה כבר מותאם לההיפותלמוס עכבר בוגר (A12) תאים; עם זאת,שיטות שתוארו ניתן לשנות כדי שיתאימו למסגרת של מחקר דומה.
מבחני ריבוב מתרבות אחת גם מספק יתרון על פני השיטה המסורתית של ביצוע מבחני בודדים מכמה סיבות. בנוסף לחיסכון בזמן, דגימות תאים, וחומרים כימיים תרבות, מבחני ריבוב יכולים גם לספק ידע של הישרדות תא ומוות, מספקים בקרות פנימיות, ולבטל את הצורך בניסויים חוזרים ונשנים 11, 12.
שיטות אלטרנטיבי יש לסמוך על כתמים מערביים או ELISAs, שהם מבחני אמינים, אבל הם יקרים וזמן רב (1-2 ימים), במיוחד בעת שימוש בפורמט 96 היטב. לא כולל את הזמן שלוקח לתאי תרבות עבור assay הריבוב, הזמן הכולל הוא פחות מ -3 שעות. בעוד פרוטוקול זה כבר מותאם לשימוש עם A12 תאים, זה יכול להיות שונה לשימוש במודלים אחרים, תוך שמירה על בגורמים נפשי שעלולות להשפיע על שלמות תא. להרתיעכרייה אם פרוטוקול זה יעבוד עבור סדרה של ניסויים תלויה במספר דוגמאות או תנאי ניסוי ועל ניסויים במורד הזרם מתוכננים.
Protocol
Representative Results
Discussion
זמנית assay הוא טכניקה מקובלת היטב כי כבר בשימוש על ידי מדענים במספר רבים של יישומים כגון microarrays PCR, immunodetection, ושיטות המבוססים על חלבונים אחרים זיהוי 13, 14. לאחרונה, מבחני ריבוב הפכו מנוצלים יותר ויותר בניסויים במבחנה המבוססת על צלחת ואומת כשיטת מדויקת להערכת cyto…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
העבודה המתוארת כאן מומנה על ידי משרד החוץ האמריקאי לענייני יוצאי צבא במעבדת המחקר ביו ופיתוח BX001686-1A1 ומחקר שיקום VA ופיתוח.
Materials
| Adult Mouse Hypothalamus Cell Line mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fetal bovine serum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitic Acid | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethy sulfoxide | Sigma-Aldrich | D2650 | |
PrestoBlue Cell Viability Reagent |
Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| Equipment | |||
| 96W Optical Bottom Plate, Black Polystyrene, Cell Culture Treated, with lid, Sterile | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Microplate | Molecular Devices |
References
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, and insulin resistance in rats fed a high-fat diet. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 296, 1003-1012 (2009).
- Moraes, J. C., et al. High-fat diet induces apoptosis of hypothalamic neurons. PloS one. 4, (2009).
- Mayer, C. M., Belsham, D. D. Palmitate attenuates insulin signaling and induces endoplasmic reticulum stress and apoptosis in hypothalamic neurons: rescue of resistance and apoptosis through adenosine 5′ monophosphate-activated protein kinase activation. Endocrinology. 151, 576-585 (2010).
- Benoit, S. C., et al. Palmitic acid mediates hypothalamic insulin resistance by altering PKC-theta subcellular localization in rodents. J. Clin. Invest. 119, 2577-2589 (2009).
- Thaler, J. P., et al. Obesity is associated with hypothalamic injury in rodents and humans. J. Clin. Invest. 122, 153-162 (2012).
- Williams, L. M. Hypothalamic dysfunction in obesity. Proc. Nutr. Soc. 71, 521-533 (2012).
- Belsham, D. D., et al. Generation of a phenotypic array of hypothalamic neuronal cell models to study complex neuroendocrine disorders. Endocrinology. 145, 393-400 (2004).
- Xiao, J., et al. Monitoring of cell viability and proliferation in hydrogel-encapsulated system by resazurin assay. Appl. Biochem. Biotechnol. 162, 1996-2007 (2010).
- Butterick, T. A., Nixon, J. P., Billington, C. J., Kotz, C. M. Orexin A decreases lipid peroxidation and apoptosis in a novel hypothalamic cell model. Neurosci. Lett. 524, 30-34 (2012).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Niles, A. L., Moravec, R. A., Riss, T. L. In vitro viability and cytotoxicity testing and same-well multi-parametric combinations for high throughput screening. Curr. Chem. Genomics. 3, 33-41 (2009).
- Steffen, W., Linck, R. W. Multiple immunoblot: a sensitive technique to stain proteins and detect multiple antigens on a single two-dimensional replica. Electrophoresis. 10, 714-718 (1989).
- Gingrich, J. C., Davis, D. R., Nguyen, Q. Multiplex detection and quantitation of proteins on western blots using fluorescent probes. Biotechniques. 29, 636-642 (2000).
- Riss, T. L., Moravec, R. A. Use of multiple assay endpoints to investigate the effects of incubation time, dose of toxin, and plating density in cell-based cytotoxicity assays. Assay Drug Dev. Technol. 2, 51-62 (2004).
- Smyth, P. G., Berman, S. A. Markers of apoptosis: methods for elucidating the mechanism of apoptotic cell death from the nervous system. Biotechniques. 32, 648-650 (2002).
- Lavrik, I. N., Golks, A., Krammer, P. H. Caspases: pharmacological manipulation of cell death. J. Clin. Invest. 115, 2665-2672 (2005).
