Hücresel Mimics İnşası için Veziküller Hücre-ücretsiz Transkripsiyon ve Çeviri Makine Sarma

1. DNA Şablon hazırlanması E. standart bir laboratuar gerilme plazmid arıtınız örneğin E. coli gibi, coli DH5a veya bir ticari kit ile Nova Mavi. Alternatif olarak, doğrusal bir PCR ürünü, benzer şekilde, ticari bir kit ile daha da arıtılabilir. Sadece H 2 O ile DNA Zehir. Fenol-kloroform DNA çözümü 26 ayıklayın. UV emme ya da diğer uygun yöntemlerle, örneğin DNA konsantrasyonu ve saflığı belirlemek. Bu, transkripsiyon, çeviri için son derece etkili bir saf DNA kullanılması önemlidir. 2. İnce Lipid Film hazırlanması Kuru lipid toz tartmak ve çözücü içinde çözülür. 1-palmitoil-2-oleoil-sn-glisero-3-fosfokolin (POPC) için, stok çözeltileri, 40 mg / ml 'lik bir konsantrasyonda kloroform içinde hazırlanır. Not: Organik çözücü madde her zaman cam pipetler ve şişeler ile ele alınması gerekir. Diğer bir deyişle, plastik kesinlikle kullanılmamalıdır. Mağaza stercihen argon altında, -20 ° C 'de hava geçirmez, çözücü dayanıklı amber cam şişeler içinde tak çözümler. 5 ml'lik bir yuvarlak tabanlı şişe içine kısım 12 mmol POPC (40 mg / ml stok çözeltisinden 220 ul). Ince bir lipid filmi elde etmek için bir döner buharlaştırıcı (Şekil 1) ile birlikte çözücü buharlaşır. Güvenli şekilde dairesel bir klip ile damıtma tüp yuvarlak tabanlı şişeye takmak ve şişenin dönüş başlar. Kondansatör bobin suyun dolaşımı başlatmak. Kloroform 61.2, düşük bir kaynama noktası ° C, normal atmosfer basıncında olduğu için bir ısıtma banyosu kullanarak, gerekli değildir. Sistem musluğunu açık olduğunu kontrol ederek atmosfere açık olduğundan emin olun. Vakum pompası açın ve yavaş yavaş sisteme vakum uygulamak için valfli yakın. Ince bir lipid filmi opak bir filmin oluşturulması için döner buharlaştırma sırasında yuvarlak tabanlı şişeye duvarlarında yatırılırBu gözle görülebilir. Döner buharlaşma 0.5-2 saat devam edelim. Süreci durdurmak için, yavaş yavaş, vakum basıncı serbest değiştirilmesini durdurmak ve yuvarlak tabanlı bir şişe çıkarın. 3. Lipid Tekrar Süspansiyonu ve veziküllü Homojenizasyon Direk tabanı yuvarlak bir şişeye ince lipid filmi için, 1 ml 2 M 18.2 H O ekleyin. Maksimum hızda şiddetle vorteks çözüm, yaklaşık 3.200 rpm, lipid filmi gözle gözlemlenebilir cam, ayrılana kadar. 2 mL mikrosantrifüj tüpü içine lipid dispersiyon aktarın. Set-up bir halka bir 5 mm uçlu bir homojenizatör tutmak için stand. Güvenli bir şekilde tutmak için yağ dispersiyonu homojenleştirici altında bir mikrosantrifüj standı yerleştirin. 18.2 MQ H 2 O ucu çeker ve birkaç saniye çalıştırarak homojenizatör dağıtma elemanı durulayın. Th sağlanması lipid dispersiyon içine doğrudan dispersiyon eleman yerleştirinucunda mikrosantrifüj tüp alt dokunmaz. Güç seviyesi 4 veya 14.000 rpm'de 1 dakika homojenize. 4. Vezikül Ekstrüzyon ve Liyofilizasyon Bir dış kılıf oluşur mini-ekstruder (Şekil 2), ve iki teflon iç zar destekler, iki O-ring, ve bir Teflon yatak evler tutucu somun parçaları birleştirin. Iç membran desteklerin oluklar içine iki O-ring yerleştirin. Prewet iki filtre ve bir 400 nm membran. Filtreler aralarında membranı ile O-ring içinde teflon karşı yerleştirilir. Membran O-halkalar arasında iki filtre ile çevrili bir membran ile ekstrüder dış kasa içine destekler yerleştirin. Muhafaza içinde teflon yatak yerleştirin ve tutucu somunu takın ve elle sıkın. Iki şırınga durulayın ve 18.2 M su ile bir doldurun. Küçük s içine şırınga iğneleri kaydedinekstruder düzeneğinin her iki ucundaki Teflon oles. Iğneler kolayca slayt gerekir, iğne zorlamayın. Ekstruder konut ve sıkın içine şırınga ile ekstruder sabitleyin. Yavaş yavaş bir şırınga dışında ve diğer içine su iterek ekstrüzyon yoluyla su geçirin. Bu, bir pasaj temsil eder. Mevcut sızıntı vardır sağlamak üç pasajların toplam tekrarlayın. Su şırınga çıkarın ve su atmayın. Numune ile bir şırınga ile doldurun, ekstrüdere bağlayın ve yukarıdaki adım 4.3 'de açıklandığı gibi yavaş zarından vezikül çözeltisi geçmektedir. 11 pasajların toplam 10x tekrarlayın. Ekstrüzyon işlemi ilerledikçe, örnek daha az bulanık ve zar boyunca itmek için kolay olacaktır. Direncinde ani bir düşüş, ancak genellikle bir membran kırılması gösterir. Ekstrüde vezikül çözüm aktarın ve mikrosantrifüj tüpleri içine veziküllerin 40 ul hacimde olun.Flaş kuru buz ya ya da sıvı azot her kısım dondurma. 30 gecede bir santrifüj evaporatör ° C ile her kısım Lyophilize -20 ° C'de liyofilize boş kesecikler Mağaza 5. Transkripsiyon-çeviri Makine Kapsüllenen Transkripsiyon yapıldı reaksiyon bileşenleri karıştırmak ve RNaz inhibitörü, 20 adet ekleyin. Buz üzerinde inkübe edin. DNA şablonu ekleyin. Bir kontrol reaksiyonu için, 250 bir plazmid kodlayan mVenus ng veya bir T7 promotörü arkasına transkripsiyonel benzer bir floresan protein ve güçlü E. coli, ribozom bağlanma yeri tavsiye edilir. RNase içermeyen su ile nihai hacim 25 ul getirin. Adım 5.3 'de monte edilmiş, reaksiyon 10 ul ile liyofilize veziküllerin Hidrat bir kısım (adım 4.6' dan itibaren). Kısaca vorteks karışım veziküller yeniden süspanse kadar. Bu en az 30 saniye almalıdır. 3 boyunca buz üzerinde inkübe edilir, reaksiyon0 dakika veziküller şişmeye izin vermek. 50 mM Tris-HCI, 50 mM NaCI, pH 7.4 ile 27.0 ml ve 20.2 mg / ml Proteinaz K DNaz ve RNaz 1.5 ul içine veziküllerin 1.5 ul ekleyerek 30 ul son hacim olması için 20 kat vezikül seyreltin Proteinaz K alternatif extravesicular malzeme düşmesine aynı zamanda bu noktada ilave edilebilir. 37, en az 2.5 saat boyunca inkübe ° C. 6. Mikroskopla inceleme Farklı zaman noktalarında veziküller ve floresan protein üretim ilerleme inceleyin. Veziküller 400 nm vezikül ekstrüzyonu için kullanılan membranın gözenek boyutundan daha büyük bir çapa sahip olacaktır. Standart bir mikroskop lamı üzerine bir 20 x 5 mm silikon ayırıcı koyarak bir örnek odası hazırlayın. Örnek odasına veziküllerin Pipet 10 ul. Odanın içinde bir silikonlu cam kapak kayma yerleştirin. Bir 63X yağ dağılımı o ile veziküller dikkatsömürülen floresan protein için uygun filtre seti kullanılarak parlak bir alan ve floresan mikroskobu ile r benzer amaçlı.