Faisant preuve d'une multi-résistante<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Amplification de puces à ADN
Summary
Un microréseau d'amplification asymétrique combine l'amplification par PCR et l'hybridation microarray dans une seule chambre, qui simplifie considérablement microarray flux de travail pour l'utilisateur final. Simplifier microarray flux de travail est une première étape nécessaire pour la création de diagnostics des biopuces qui peuvent être utilisées en routine dans des environnements à faibles ressources.
Abstract
Simplifier microarray flux de travail est une première étape nécessaire pour la création de MDR-TB diagnostic des biopuces qui peuvent être utilisées en routine dans des environnements à faibles ressources. Un microréseau d'amplification combine amplification PCR asymétrique, la sélection de la taille de la cible, l'étiquetage cible, et microarray hybridation dans une solution unique et dans une seule chambre microfluidique. Une méthode de traitement par lots est démontrée avec un mélange maître asymétrique 9 complexes et à faible densité élément de gel pour le génotypage microréseau multi-drogue Mycobacterium tuberculosis résistantes (MDR-TB). Le protocole décrit ici peut être complété en 6 heures et fournir correct génotypage d'au moins 1 000 équivalents cellulaires d'ADN génomique. L'intégration sur puce des étapes de lavage est possible, qui se traduira par une méthode d'amplicon entièrement clos et système. L'étendue de multiplexage avec un microréseau d'amplification est finalement limitée par le nombre de paires d'amorces qui peuvent être combinés en un seul maître mix et encore obtenir une sensibilité désirée et des mesures de performance de spécificité, plutôt que le nombre de sondes qui sont immobilisées sur la matrice. De même, le temps total d'analyse peut être raccourcie ou allongée en fonction de l'utilisation spécifique prévue, question de recherche, et les limites souhaitées de détection. Néanmoins, l'approche générale simplifie considérablement microarray flux de travail pour l'utilisateur final en réduisant le nombre d'étapes manuellement intensives et longues traitement, et fournit une voie biochimique et microfluidique simplifiée pour traduire diagnostic des biopuces dans la pratique clinique de routine.
Introduction
La détection précoce des cas et un traitement rapide sont considérés comme des stratégies de lutte les plus efficaces pour réduire Mycobacterium tuberculosis (MTB) transmission 1, et il est maintenant un large consensus dans la communauté de la tuberculose que d'un point de service (PDS) ou près de test de POC pour diagnostiquer simultanément la tuberculose et la résistance aux médicaments (DR) est nécessaire. Les technologies telles que GeneXpert de Cepheid et autres tests d'amplification des acides nucléiques de réduire le temps de diagnostic pour de nombreux patients atteints de tuberculose, et fournissent une lecture rapide indique la résistance à la rifampicine ou mutations sélectionnées conférant une résistance à d'autres médicaments de première ou deuxième ligne 2. Bien que les tests d'amplification en temps réel et de l'acide nucléique isotherme sont conçus pour identifier les mutations de résistance aux médicaments qui mènent à la TB-MR, le spectre des mutations qu'ils détectent est souvent insuffisante pour concevoir un schéma thérapeutique individualisé correspondant au profil de résistance aux médicaments du patient, et les contraintes techniques liéesà la diaphonie optique ou de la complexité de l'amplification et de reporting chimiques 3 au 7 mai limiter le nombre de loci ou des mutations qui sont détectés. Ainsi, les technologies de détection avec une capacité de multiplexage élevé sont nécessaires pour combler les lacunes connues dans le diagnostic de TB-MR au PS.
Les puces à ADN et les Hain essais de sonde de la ligne approuvée par l'OMS peuvent répondre à la «gène multiple, multiples mutations" défi de diagnostiquer la TB-MR 8-29. Malheureusement, ces plates-formes, de détection multiplex à base d'hybridation utilisent plusieurs étapes, compliqué, et les protocoles ouverts amplicon qui exigent une formation importante et la maîtrise des techniques moléculaires. L'amplification microréseau 30 a été conçu pour répondre à certaines de ces puces à ADN flux de travail et des problèmes opérationnels. Les principes fluidiques sont simplificatrices pour amplifier, s'hybrident, et détecter des cibles d'acides nucléiques dans une seule chambre microfluidique. L'utilisateur introduit les acides nucléiques et d'amplification master mélanger dans une chambre fluidique avec une pipette et commence le protocole de cycle thermique. Pour la méthode de traitement par lots représenté ici, les microréseaux sont ensuite lavées dans une solution en vrac, séchées et imagés. Cette étude démontre la fonctionnalité d'un microréseau d'amplification à l'aide d'un test de TB-MR microarray pour rpoB (30 mutations), katG (2 mutations), inhA (4 mutations), rpsL (2 mutations), embB (1 mutation), IS1245, IS6110 , et une amplification interne et de contrôle de l'hybridation. Au moins une paire appariée de microréseau de sondes (type sauvage (WT) et mutantes de nucléotide unique (MU)) est inclus pour chaque mutation d'intérêt. Acides nucléiques purifiés à partir de multi-drogue M. résistant la tuberculose sont de la souche TDR tuberculose 31 Banque. puces d'éléments de gel sont fabriqués sur des substrats de verre par copolymérisation essentiellement comme décrit par ailleurs 32, sauf que nous utilisons 4% de monomère et 0,05 mM chaque sonde dans le polymérisablesmélange d'ation. Les tableaux sont entourés d'un joint de 50 ml avant l'utilisation. Après cyclage thermique, hybridation et lavage étapes, les puces d'amplification sont visualisés sur un analyseur portable Akonni. Fond corrigée, les intensités de signaux intégrés sont obtenus à partir de la première. Images tif en utilisant un algorithme de cercle fixe. Bruit pour chaque élément en gel est égale à trois fois l'écart type des milieux de tache locales. cibles de gènes sont généralement considérés comme détectable pour le rapport signal sur bruit (SNR) des valeurs ≥ 3. Afin de déterminer la présence ou l'absence d'une mutation spécifique dans chaque gène ou codon, un rapport discriminant est calculée à partir des valeurs de SNR que (WT-MU) / (WT + MU). Ratios discriminants <0 sont indicatifs d'une mutation de résistance aux médicaments au niveau du locus, tandis que les ratios> 0 sont indicatifs de la séquence de type sauvage.
Protocol
Representative Results
Discussion
L'étendue de multiplexage avec un microréseau d'amplification est finalement dictée par l'efficacité de la PCR multiplex asymétrique, et non le microréseau. Dans notre expérience, 10-12 paires d'amorces uniques peuvent être facilement multiplexés dans un format amplification de puces à ADN. Critères d'amorces et de conception de la sonde classiques s'appliquent donc à de nouveaux essais, à l'exception que l'on doit aussi tenir compte des interactions potentielles entre les ac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (NIH) sous subvention RC3 AI089106.
Acides nucléiques de MDR-TB ont été fournis par le Fonds / développement des Nations Unies Programme / Banque mondiale / Organisation mondiale de la Santé Programme spécial des Nations Unies pour l'enfance pour la recherche et la formation concernant les maladies tropicales (TDR), Genève, Suisse.
Nous remercions le Dr Tom Shinnick des US Centers for Disease Control and Prevention des indications sur les gènes et les mutations spécifiques à inclure dans le test de prototype.
Materials
| MDR-TB amplification microarrays, with applied gasket and pre-cut cover slips | Akonni Biosystems | Inquire | |
| Multiplex PCR kit, containing 2X PCR buffer with HotStar Taq plus | Qiagen | #206143 | |
| Taq polymerase | Qiagen | #201207 | |
| RNAse-free water | Qiagen | #206143 | |
| Formamide | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP227-500 | |
| 20 mg mL-1 non-acetlyated bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | #3B6917 | |
| 5X concentrated MDR-TB primer mix | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 500 fg uL-1 amplification and inhibition control | Akonni Biosystems | Inquire | |
| 20X SSPE | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP1328-4 | |
| Triton X-100 | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #BP151-500 | |
| Disinfecting Spray | Current Technologies, Inc. | #BRSPRAY128 | |
| 70% Isopropyl Alcohol | Decon Labs, Inc. | #8416 | |
| Equipment | Company | Catalog Number | |
| Microarray imager, with automated image and data analysis software | Akonni Biosystems | 100-20011 | |
| Thermal cycler with flat block insert | Akonni Biosystems | 100-10021 | |
| High-throughput wash station and slide holder | ArrayIt | HTW | |
| Dissecting forceps | Thermo Fisher Scientific, Inc. | #10-300 | |
| Mini Vortexer | VWR | #3365040 | |
| Mini-centrifuge | VWR | #93000-196 | |
| Airbrush Compressor Kit | Central Pneumatic | #95630 |
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