Aantonen van een multiresistente<em> Mycobacterium tuberculosis</em> Versterking Microarray

Vroege opsporing en snelle behandeling worden beschouwd als de meest effectieve controle strategieën om Mycobacterium tuberculosis (MTB) transmissie ¹ verminderen, en er is nu een brede consensus in de tbc-gemeenschap die een point of care (POC) of in de buurt POC test om gelijktijdig diagnosticeren TB en resistentie tegen (DR) nodig. Technologieën zoals Cepheid GeneXpert en andere nucleïnezuur amplificatie testen verminderen de tijd tot de diagnose voor veel tbc-patiënten, en zorgen voor een snelle uitlezing aangeeft resistentie tegen rifampicine of geselecteerde mutaties die resistentie tegen andere eerste of tweede lijn drugs ^2. Hoewel realtime isotherme nucleïnezuur amplificatie zijn bedoeld om de resistentie mutaties die leiden tot MDR-TB identificeren, het spectrum van mutaties detecteren ze vaak ontoereikend om een ​​geïndividualiseerd drugregime overeenkomt met de resistentie profiel van de patiënt te ontwerpen, en technische beperkingen met betrekkingoptische overspraak of de complexiteit van amplificatie en rapportage chemische ^{03-07 mei} het aantal loci of mutaties die worden gedetecteerd beperken. Zo detectie technologieën met een hogere multiplexing capaciteit nodig zijn om bekend hiaten in MDR-TB POC diagnostiek.

Microarrays en de WHO-onderschreven Hain lijnprobe testen kunnen de "meerdere genen, meerdere mutaties" uitdaging van de diagnose van MDR-TB ^8-29 pakken. Helaas zijn deze hybridisatie gebaseerde, multiplex detectie platforms gebruiken multistep, ingewikkeld, en open-amplicon protocollen die significante opleiding en deskundigheid in de moleculaire technieken vereisen. De amplificatie microarray ³⁰ is ontworpen om een aantal van deze microarray workflow en operationele problemen aan te pakken. De vereenvoudiging van vloeibare principes zijn aan te vullen, hybridiseren, en detecteren nucleïnezuur doelen binnen een enkele microfluïdische kamer. De gebruiker nucleïnezuur en amplificatie introduceert master mengen in een vloeibare kamer met een pipet en begint de thermische cycli protocol. Voor de batchverwerking methode hier getoond, zijn microarrays vervolgens gewassen in bulk oplossing, gedroogd, en afgebeeld. Deze studie toont de functionaliteit van een amplificatie microarray met een MDR-TB microarray test voor rpoB (30 mutaties), KATG (2 mutaties), inha (4 mutaties), rpsL (2 mutaties), embB (1 mutatie), IS1245, IS6110 en een interne amplificatie en hybridisatie controle. Ten minste een matched pair van microarray probes (wild-type (WT) en single-nucleotide mutant (MU)) is opgenomen voor elke mutatie van belang. Gezuiverde nucleïnezuren uit multiresistente M. tuberculose van de TDR Tuberculose Strain Bank ^31. Gel element microarrays worden geproduceerd op glassubstraten door copolymerisatie hoofdzaak zoals elders ³² beschreven, behalve dat we 4% monomeer en 0,05 mM elke probe in de polymerizatie mengsel. Arrays zijn omgeven met een 50 ml pakking voor gebruik. Na thermische cycli, hybridisatie en wassen stappen, zijn versterking microarrays afgebeeld op een Akonni draagbare analyzer. -Achtergrond gecorrigeerde, geïntegreerde signaal intensiteiten worden verkregen uit de ruwe. Tif beelden met behulp van een vaste cirkel algoritme. Noise elk gel-element wordt berekend als drie maal de standaardafwijking van de lokale plek achtergronden. Gendoelstellingen worden doorgaans beschouwd detecteerbaar voor signaal-ruisverhouding (SNR)-waarden ≥ 3. Om de aanwezigheid of afwezigheid van een specifieke mutatie in elk gen of codon bepalen, wordt een discriminant verhouding berekend uit de SNR waarden (WT-MU) / (WT + MU). Discriminant verhoudingen <0 zijn indicatief voor een resistentie mutatie op de locus, terwijl verhoudingen> 0 zijn aanwijzingen voor de wild-type sequentie.