Bu çalışma, bir yetişkin zebra balığı, hareketsiz entübe ve kayıtları ve bozulmamış bir hayvanda nöral faaliyet işleme izin vermek için in vivo elektrofizyolojik deneyler için nasıl kullanılabileceğini açıklar.
Daha önce, erişkin zebrabalıkları elektrofizyolojik çalışmalar hazırlıklarını veya göz fincan hazırlıkları ve electrorentinogram kayıtları dilim sınırlı olmuştur. Bu çalışma, nöral faaliyet kayıt sağlayan, bir yetişkin zebra balığı, hareketsiz entübe ve in vivo elektrofizyolojik deneyler için nasıl kullanılabileceğini açıklar. Yetişkin immobilizasyonu yanaktan ve operküler hareketinin yerine solungaçları çözülmüş oksijen sağlamak için bir mekanizma gerekmektedir. Bu teknik ile, hayvanların hareketsiz ve bu şartı yerine getirmek için bir habitat su ile perfüze. Kranyotomi tricaine metansülfonat altında gerçekleştirilir (MS-222; tricaine) anestezi beyne erişimi sağlamak için. Birincil elektrod dışı beyin aktivitesini kaydetmek için kraniotomi penceresi içinde konumlandırılmış. Bir Multitube perfüzyon sisteminin kullanımı sayesinde, farmakolojik bileşikler, çeşitli nöral aktivitede yetişkin balık ve herhangi bir değişiklik için uygulanabilirgözlenebilir. Metodoloji nörolojik etkinlik değişiklikler ile ilgili yapılacak gözlemler sağlar değil, aynı karşılaştırmalar larva ve yetişkin zebrabalıkları arasında yapılacak için de izin verir. Bu araştırmacılara nedeniyle farklı yaşam evrelerinde çeşitli bileşiklerin tanıtımı nörolojik aktivite değişiklikleri tanımlamak için yeteneği verir.
Bu makalede, bir protokol zebrabalıkları yetişkin nöral faaliyet vivo kayıtları elde etmek için tarif edilmektedir. Ekstrasellüler kayıt yöntemleri nöral doku küçük bir bölge içinde elektriksel aktivitenin gerilim ölçümleri sağlayan kullanılır. Soruşturma Bu yöntem, bir hayvanda davranıyor 1 hücrelerin çok sayıda izleme içerir. Daha önce, dilim kayıtları göz kupası hazırlıkları ve elektroretinogram kayıtları gibi, yetişkin ve larva hem de yapılmıştır. Bu deneyler büyük ölçüde çeşitli duyu sistemlerinin 2-5 fizyolojik tepkiler detay yapılmıştır. Yakın zamana kadar, sağlam beyin preparatlar sadece solunum ve oksijen difüzyon deri yoluyla oluşabilir zebra balığı larvası 3,6,7, elektrofizyoloji ile yerine getirilmesi için mevcut olmuştur. Bizim hazırlık hayvan o tamamen bilinçli ve farkında kalır bir yetişkin zebrafish yerli nörolojik etkinlik ölçülecek sağlarf çevresi.
Zebra balığı (Br.rerio) şu anda, genetik toksikolojik, farmakolojik ve fizyopatolojik çalışmalar 3 için bir model olarak temel bir rol oynamaktadır. Onlar genetik, nöral ve endokrin seviyelerinde 8 memelilerin kapsamlı benzerliği paylaşmak çünkü Zebra nörobilim alanında görünürlük kazanmıştır. Geçtiğimiz on yıl içinde, standart nöroanatomik immünohistokimyasal teknikler ve zebra balığı sinir sistemi 9-12 arasında ve farklı nörotransmitterlerin 3,8,13 dağılımının ayrıntılı karakteristik organizasyon belirlemek için kullanılmıştır. Daha yakın zamanlarda, araştırmacılar davranışsal süreçler 16-19 ve duyu sistemlerinin 2,13,20 elektrofizyolojik özellikleri üzerine ortalamak birçoğu fonksiyonel çalışmalar 14,15, onların odak değiştirdi. Bu çalışmaların az sayıda Adul belirli alanların elektriksel aktivitesi üzerinde yoğunlaşmıştırzebra balığı beyin 21-23 t, ama in vivo yaklaşımı kullanılarak gerçekleştirilmiştir değildi.
Bu protokol, spesifik beyin bölgelerinde aktivitesinin modellerini açıklamak için Zebrafish sinir sistemi içerisinde, hem kendiliğinden ve uyarılmış aktivite elektrofizyolojik çalışmaları için uyarlanabilir. Bu tekniğin kullanımı, karşılaştırmalar, genç larva ve yetişkinlerin nörolojik aktivitesi arasındaki yapılmasını sağlar. Bundan başka, protokol genetik ya da farmakolojik değişiklikler arasında karşılaştırmalar izin verir. Birlikte bu tür genetik mühendisliği veya farmakolojik testleri gibi diğer yaklaşımlar ile, bu yöntem, geç başlangıçlı, epilepsi ya da nörodejeneratif süreçler üzerinde çalışılması gibi olası uygulamalar için nöronal iletişim ve plastisite sağlam bir yetişkin hayvan hem de fonksiyonel analizi için yeni bir olanak sunmaktadır.
Bu protokol, in vivo olarak yetişkin zebrabalıkları nöral aktivitesini ölçmek için kullanılmıştır. Kaydedilen etkinlik özellikleri (genlik ve etkinlikleri şekli), ayrı ayrı balıklar arasında değişebilir ama uygulama ile, sinir aktivitesi, sürekli olarak gözlemlenebilir. Dışı kayıt tekniğinin kullanılması bu gözlemi açıklayabilir. Yöntem, bir bölge içinde 1 hücreleri, çok sayıda eş zamanlı olarak izlenmesini sağlar, bu nedenle birinci elektrot konumlandırma var…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışma (TMD, JDL ve ATS) NIH / NINDS Grant R01NS070159 tarafından desteklenmiştir.
70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
Sponge | Small pore and chemical-free | ||
Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
9 V Battery | |||
Wires with alligator clips | Need 2 | ||
37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
1/8 in diameter tube | |||
1 cm diameter tube | |||
1 mm diameter tube | |||
Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
3-way Stopcocks with Luer connections | |||
1-way Stopcock with Luer connection | |||
Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
Axoclamp software | Molecular Devices | ||
HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
10 ml Luer lock syringe | |||
1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
Microsoft-based PC | Dell | ||
Faraday Cage | |||
Air Table | |||
Dissecting Microscope |