Elektrofysiologische opname in de hersenen van Intact Adult zebravis
Summary
Dit document beschrijft hoe een volwassen zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd, geïntubeerd, en gebruikt voor in vivo elektrofysiologische experimenten opnamen en manipulatie van neurale activiteit in een intact dier mogelijk maken.
Abstract
Eerder hebben elektrofysiologische studies bij volwassen zebravis beperkt tot preparaten of in oog cup voorbereidingen en electrorentinogram opnames snijden. Dit document beschrijft hoe een volwassen zebravissen kunnen worden geïmmobiliseerd, geïntubeerd, en gebruikt voor in vivo elektrofysiologische experimenten, geschikt voor opname van neurale activiteit. Immobilisatie van de volwassene is een mechanisme vereist om opgeloste zuurstof te leveren aan de kieuwen in plaats van buccale en opercular beweging. Met onze techniek, worden de dieren geïmmobiliseerd en perfusie van habitats met water om deze eis te voldoen. Een craniotomie wordt uitgevoerd onder tricaïne methaansulfonaat (MS-222, tricaïne) anesthesie toegang tot de hersenen verschaffen. De primaire elektrode wordt dan geplaatst in de craniotomie venster extracellulaire hersenactiviteit opnemen. Door het gebruik van een multitube perfusie systeem, een grote farmacologische verbindingen in de neurale activiteit worden toegediend aan de volwassen vissen en eventuele veranderingenkan worden waargenomen. De methode maakt het mogelijk niet alleen voor opmerkingen worden gemaakt met betrekking tot veranderingen in de neurologische activiteit, maar het maakt het ook vergelijkingen worden gemaakt tussen larven en volwassen zebravis. Dit geeft onderzoekers de mogelijkheid om de veranderingen in neurologische activiteit te identificeren door de invoering van verschillende verbindingen in verschillende ontwikkelingsstadia.
Introduction
In dit artikel wordt een protocol beschreven voor het verkrijgen van in vivo opnames van neurale activiteit bij volwassen zebravissen. Extracellulaire technieken worden gebruikt, waardoor de spanning metingen van elektrische activiteit in een klein gebied van zenuwweefsel. Deze onderzoeksmethode volgt men een groot aantal cellen in een dier gedragen 1. Eerder hebben slice opnamen uitgevoerd bij zowel volwassenen als larven, evenals oog cup voorbereidingen en electroretinogram opnames. Deze experimenten zijn grotendeels uitgevoerd detail fysiologische reacties van verschillende sensorische systemen 2-5. Tot voor kort waren intactehersenen preparaten alleen voor het uitvoeren elektrofysiologie met zebravissen larve 3,6,7, waarbij ademhaling en zuurstof diffusie kan optreden door de huid is. Onze voorbereiding kan de inheemse neurologische activiteit van een volwassen zebravissen te meten, terwijl het dier blijft volledig bij bewustzijn en bewust of zijn omgeving.
Zebravis (Danio rerio) spelen momenteel een fundamentele rol als model voor genetische, toxicologische, farmacologische en fysiopathologische studies 3. Zebravis hebben zichtbaarheid binnen het gebied van de neurowetenschappen opgedaan, omdat ze delen uitgebreide homologie met zoogdieren in de genetische, neurale en endocriene niveau 8. In de afgelopen tien jaar hebben standaard neuro-anatomische en immunohistochemische technieken zijn gebruikt om de gedetailleerde kenmerkende organisatie van de zebravis zenuwstelsel 9-12 en van de verdeling van de verschillende neurotransmitters 3,8,13 bepalen. Meer recent hebben onderzoekers hun focus naar functionele studies 14,15, waarvan vele centreren op gedragsprocessen 16-19 en elektrofysiologische kenmerken van sensorische systemen 2,13,20. Een klein aantal van deze studies hebben zich geconcentreerd op de elektrische activiteit van specifieke gebieden van de adult hersenen zebravis 21-23, maar werden niet uitgevoerd met behulp van een in vivo benadering.
Dit protocol kan worden aangepast voor elektrofysiologische studies van zowel spontane en uitgelokte activiteit in het zebravis zenuwstelsel de activiteitspatronen beschrijven specifieke hersengebieden. Het gebruik van deze techniek maakt vergelijkingen worden gemaakt tussen de neurologische activiteit van jonge larvale stadia en volwassenen. Verder, ons protocol maakt vergelijkingen tussen genetische of farmacologische veranderingen. Samen met andere benaderingen, zoals genetische manipulatie of farmacologische proeven, biedt deze methode een nieuwe mogelijkheid voor de functionele analyse van neuronale communicatie en plasticiteit in de intacte volwassen dier en voor mogelijke toepassingen, zoals het bestuderen late onset epilepsie en neurodegeneratieve processen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol is gebruikt om de neurale activiteit van volwassen zebravissen in vivo meten. Met de praktijk, kunnen neurale activiteit consequent worden nageleefd, hoewel de kenmerken (amplitude en de vorm van gebeurtenissen) van de opgenomen activiteit kan variëren tussen individuele vissen. Benutting van de extracellulaire techniek kan deze waarneming verklaren. De methode omvat gelijktijdige controle van een groot aantal cellen in een gebied 1, waardoor de verschillen in de positionering van de pr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH / NINDS Grant R01NS070159 (tot TMD, JDL en ATS).
Materials
| 70% Ethanol | Decon Laboratories | 2750HC | Dilute 100% to 70% with DI water |
| 2 M Potassium Chloride | J.T. Baker | ||
| 2 M Sodium Chloride | J.T. Baker | 3624-05 | |
| 0.4% Tris-Buffered Tricaine | Sigma-Aldrich | E10521 | pH 7.2-7.4; stored at -20 oC |
| Pancuronium Bromide | Sigma-Aldrich | P1918 | Diluted to 1 μg/μl in 1x phosphate buffered saline |
| Habitat water | pH 7.0-7.4, conductivity of 400-450 μS; maintained by Instant Ocean and Sodium Bicarbonate | ||
| Pentylenetetrazol | Sigma-Aldrich | P6500 | Diluted to 300 mM in 1x phosphate buffered saline |
| Nanofil syringe | World Precision Instruments, Inc. | 06A | |
| 34 G Beveled needle | World Precision Instruments, Inc. | NF34BV | |
| Sponge | Small pore and chemical-free | ||
| Foam-backed fine sand paper | 5 x 5 cm2 is large enough | ||
| 9 V Battery | |||
| Wires with alligator clips | Need 2 | ||
| 37 cm x 42 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KEM | |
| 11 cm x 21 cm Kimwipe | Kimberly-Clark Professional | TW31KWP | |
| 1/8 in diameter tube | |||
| 1 cm diameter tube | |||
| 1 mm diameter tube | |||
| Reducing valve with female Luer lock cap and silicone ferrule | Qosina | 51505 | |
| Microscope (Leica MZ APO) | Another microscope can be used | ||
| Vanna scissors | Roboz Surgical Instruments Co., Inc. | 15018-10 | |
| 60 ml Luer lock syringe tubes | Becton, Dickinson and Company | 309653 | |
| 3-way Stopcocks with Luer connections | |||
| 1-way Stopcock with Luer connection | |||
| Fisherbrand 100 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | NC9299146 | |
| Fisherbrand 60 mm x 15 mm Petri dish | Fisher Scientific | S67961 | |
| 4 in Borosilicate capillary tube | World Precision Instruments | TW100F-4 | Can contain a filament to aid in filling with solution |
| P-97 Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | ||
| Digidata 1440 | Molecular Devices | ||
| Axon Aloclamp 900A | Molecular Devices | ||
| Axoclamp software | Molecular Devices | ||
| HS-9Ax 1U headstage | Molecular Devices | ||
| 0.010 in Silver wire | A-M Systems, Inc. | ||
| Q-series electrode holder | Warner Instruments | QSW-A10P | |
| 10 ml Luer lock syringe | |||
| 1 mm x 15 in Tubing | Connect Luer lock syringe to Q-series electrode holder | ||
| Micromanipulator | Warner Instruments | Need 2 | |
| Microsoft-based PC | Dell | ||
| Faraday Cage | |||
| Air Table | |||
| Dissecting Microscope |
References
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. J. Neurophysiol. 84, 390-400 (2000).
- Gabriel, J. P., et al. Locomotor pattern in the adult zebrafish spinal cord in vitro. J.Neurophysiol. 99, 37-48 (2008).
- Vargas, R., Johannesdottir, I. T., Sigurgeirsson, B., Thornorsteinsson, H., Karlsson, K. A. The zebrafish brain in research and teaching: a simple in vivo and in vitro model for the study of spontaneous neural activity. Adv Physiol Educ. 35, 188-196 (2011).
- Makhankov, Y. V., Rinner, O., Neuhauss, S. C. An inexpensive device for non-invasive electroretinography in small aquatic vertebrates. J. Neurosci. Methods. 135, 205-210 (2004).
- Brockerhoff, S. E., et al. A behavioral screen for isolating zebrafish mutants with visual system defects. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. 92, 10545-10549 (1995).
- Baraban, S. C., Taylor, M. R., Castro, P. A., Baier, H. Pentylenetetrazole induced changes in zebrafish behavior, neural activity and c-fos expression. Neuroscience. 131, 759-768 (2005).
- Baraban, S. C., et al. A large-scale mutagenesis screen to identify seizure-resistant zebrafish. Epilepsia. 48, 1151-1157 (2007).
- Maximino, C. . Serotonin and anxiety: Neuroanatomical, pharmacological and functional aspects. , (2012).
- Bally-Cuif, L., Vernier, P., Perry, S. F., Ekker, M., Farrell, A. P., Brauner, C. J. . Fish Physiology: Zebrafish. 29, (2010).
- Kaslin, J., Nystedt, J. M., Ostergard, M., Peitsaro, N., Panula, P. The orexin/hypocretin system in zebrafish is connected to the aminergic and cholinergic systems. J. Neurosci. 24, 2678-2689 (2004).
- McLean, D. L., Fetcho, J. R. Ontogeny and innervation patterns of dopaminergic, noradrenergic, and serotonergic neurons in larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 38-56 (2004).
- Mueller, T., Vernier, P., Wullimann, M. F. The adult central nervous cholinergic system of a neurogenetic model animal, the zebrafish Danio rerio. Brain Res. 1011, 156-169 (2004).
- Higashijima, S., Schaefer, M., Fetcho, J. R. Neurotransmitter properties of spinal interneurons in embryonic and larval zebrafish. J. Comp. Neurol. 480, 19-37 (1002).
- Tao, L., Lauderdale, J. D., Sornborger, A. T. Mapping Functional Connectivity between Neuronal Ensembles with Larval Zebrafish Transgenic for a Ratiometric Calcium Indicator. Front Neural Circuits. 5, 2 (2011).
- Fan, X., et al. New statistical methods enhance imaging of cameleon fluorescence resonance energy transfer in cultured zebrafish spinal neurons. J Biomed Opt. 12, 034017 (2007).
- Burgess, H. A., Granato, M. Sensorimotor gating in larval zebrafish. J. Neurosci. 27, 4984-4994 (2007).
- Burgess, H. A., Schoch, H., Granato, M. Distinct retinal pathways drive spatial orientation behaviors in zebrafish navigation. Curr. Biol. 20, 381-386 (2010).
- Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Behavioral neurobiology: how larval fish orient towards the light. Curr. Biol. 20, 159-161 (2010).
- Haug, M. F., Biehlmaier, O., Mueller, K. P., Neuhauss, S. C. Visual acuity in larval zebrafish: behavior and histology. Front. Zool. 7, 8 (2010).
- Fetcho, J. R., Higashijima, S., McLean, D. L. Zebrafish and motor control over the last decade. Brain Res.Rev. 57, 86-93 (2008).
- Connaughton, V. P., Nelson, R., Bender, A. M. Electrophysiological evidence of GABAA and GABAC receptors on zebrafish retinal bipolar cells. Vis. Neurosci. 25, 139-153 (2008).
- Kim, Y. J., Nam, R. H., Yoo, Y. M., Lee, C. J. Identification and functional evidence of GABAergic neurons in parts of the brain of adult zebrafish (Danio rerio). Neurosci. Lett. 355, 29-32 (2004).
- Sato, Y., Miyasaka, N., Yoshihara, Y. Hierarchical regulation of odorant receptor gene choice and subsequent axonal projection of olfactory sensory neurons in zebrafish. J. Neurosci. 27, 1606-1615 (2007).
- Westerfield, M. . The zebrafish book: a guide for the laboratory use of zebrafish (Brachydanio rerio). , (1993).
- Lazarova, M., Samanin, R. Potentiation by yohimbine of pentylenetetrazol-induced seizures in rats: role of alpha 2 adrenergic receptors. Pharmacol. Res. Commun. 15, 419-425 (1983).
- Loscher, W., Honack, D., Fassbender, C. P., Nolting, B. The role of technical, biological and pharmacological factors in the laboratory evaluation of anticonvulsant drugs. III. Pentylenetetrazole seizure models. Epilepsy res. 8, 171-189 (1991).
- DeMicco, A., Cooper, K. R., Richardson, J. R., White, L. A. Developmental neurotoxicity of pyrethroid insecticides in zebrafish embryos. Toxicol Sci. 113, 177-186 (2010).
- Arnolds, D. E., et al. Physiological effects of tricaine on the supramedullary/dorsal neurons of the cunner, Tautogolabrus adspersus. Biol. Bull. 203, 188-189 (2002).
