Propriocepção e tensão Receptores em Caranguejo Limbs: Exercícios Laboratório Student
Summary
Técnicas fisiológicas e anatômicas são demonstrados para lidar com a função e estrutura para proprioceptores articulares e receptores de tensão muscular em membros de passeio de crustáceos.
Abstract
O principal objetivo desses procedimentos é o de demonstrar para fins de ensino e pesquisa como gravar a atividade dos neurônios sensoriais primários vivendo responsáveis pela propriocepção como eles estão detectando posição conjunta e movimento, e tensão muscular. A atividade elétrica de proprioceptores crustáceos e receptores de tensão é gravado por instrumentação neurofisiológica básico, e um transdutor é usado para medir simultaneamente força que é gerada pela estimulação de um nervo motor. Além disso, demonstramos como marcar os neurônios para uma rápida avaliação de sua disposição anatômica ou para fixação permanente. Coloração revela organização anatômica que é representante de órgãos chordotonal na maioria dos crustáceos. Comparando as respostas nervosas tensão às respostas proprioceptivo é uma ferramenta de ensino eficaz na determinação de como estes neurónios sensoriais são funcionalmente definidos como a anatomia e está correlacionada com a função. Três técnicas de coloraçãosão apresentados permitindo aos pesquisadores e instrutores para escolher um método que é ideal para o seu laboratório.
Introduction
A propriocepção é a sensação de posição dos membros e movimento que permite que o comportamento motor coordenada. Propriocepção consistem em posição (estático) e movimento (cinestésicas) receptores. Em insetos e crustáceos, os órgãos chordotonal são as estruturas que fornecem essas informações para o SNC 1. Nem todos os órgãos chordotonal abrangem um conjunto, mas eles ainda podem monitorar movimentos articulares devido ao seu apego às apodemes (tendão como estruturas), que abrangem todo o conjunto e se movem em associação com o músculo esquelético e articulação conjunta. Pernas de caranguejo tem seis articulações, cada uma tendo um ou dois órgãos chordotonal 2. Normalmente, um órgão chordotonal tem 60-100 ou mais neurônios sensoriais embutidos dentro de um fio elástico, neurônios que sinalizam posição conjunta estática, direção e velocidade do movimento 3-6. A entrada a partir de órgãos chordotonal em cada junta e perna é então processado centralmente permitindo movimentos coordenados dos animais.
<p class="jove_content"> As forças que produzem os músculos da perna durante as contrações isométricas e isotônicas são detectados por receptores de tensão associados com as fibras musculares e seus anexos a apodemes7-9. Nos protocolos de curta perna de crustáceos que se seguem apresentamos metodologia para gravações de neurônios sensoriais primários que monitoram a propriocepção e os neurônios que respondem a forças geradas por fibras musculares. Também é apresentada uma técnica para activar os movimentos das pernas e quantificar a geração de forças, bem como técnicas de anatómicas que podem ser utilizados para caracterizar o arranjo destas estruturas do sistema nervoso periférico.Os procedimentos demonstrados abaixo permitem a análise estrutural e funcional dos neurónios que enervam os dois tipos de receptores em relação à sua localização sobre um fio elástico e chordotonal apodeme. Para ilustrar, usamos o propodite-dactylopodite (PD) órgão chordotonal, o órgão que abrange o segmento mais distal da perna de caranguejo 3.Embora estudos eletrofisiológicos detalhados começou na década de 1930 e ainda estão sendo realizadas hoje, alguns aspectos tornaram-se conhecidos sobre as conexões segmentares de proprioceptores nas diversas articulações e seus papéis no controle coordenado de muscles10-16. Estabelecer a relação estrutura-função entre os órgãos proprioceptivos, músculos e do sistema nervoso irá ainda ajudar a definir esses papéis. Por exemplo, a rotulagem do somata e terminações distais dos neurônios tensão inseridos no apodeme irá revelar sua localização em relação às fibras musculares 8,17-21.
Apresentamos três técnicas de coloração para as pernas de crustáceos que podem ser utilizados na investigação ou laboratórios acadêmicos. Coloração azul de metileno fornece o contraste adequado para músculos e nervos e é recomendado como uma técnica simples para os alunos aprenderem anatomia. Labs, que têm configurações de microscopia de fluorescência pode realizar a coloração mais neuronal selectiva expondo brevemente o nervos para o corante vital 4-di-2-ASP. A terceira alternativa é CoCl 2 aterramento, que mancha e corrige os neurônios, e não necessita de imagens de fluorescência. Embora seja trabalho e tempo intensivo, este processo de coloração dá alto contraste e especificidade para os nervos que são preenchidos. Juntas, essas técnicas podem ser usadas para comparar vários órgãos chordotonal, não apenas dentro de um membro ou entre os membros, mas também entre outros crustáceos e insetos espécies 20-22. Caranguejos azuis (C. sapidus) usados em gravações fisiológicas e para a coloração anatômica estão prontamente disponíveis em todo a fronteira sul e sudeste dos Estados Unidos. Esta espécie serve como um representante dos arranjos nervosas chordotonal e tensão encontrados na maioria dos caranguejos. Laboratórios na costa oeste vai preferir usar o muito maior caranguejo Dungeness (magister Câncer) para estes experimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
O objectivo deste conjunto de experimentos é 1) para ensinar e expor os princípios fundamentais de gravações extracelular de um órgão proprioceptivo identificáveis e nervo tensão e 2) de salientar a importância do mapeamento anatômico em relação à função fisiológica de sistemas sensoriais particulares. Esta abordagem experimental e os modelos animais utilizados são relativamente baratos e fáceis de conduzir, em laboratórios de ensino neurofisiologia.
Os neurônios dos órgãos chordotonal são de dois tipos funcionais específicos, aqueles que respondem ao movimento e aqueles que respondem a posições estáticas. Gravações celulares solteiro a partir de uma variedade de órgãos chordotonal, não importa qual conjunto é examinada, têm mostrado que este seja o caso 3,5. De fato, os órgãos chordotonal associados às articulações antenares de lagostas revelar os mesmos dois tipos sensoriais e anatomia básica 27. Além de haver dois tipos de neurônios (movimento e positidiante), os neurônios compartilham o mesmo arranjo anatômico em seus respectivos cordões elásticos. A grande somata localizado proximalmente na costa tendem a pertencer aos neurônios sensíveis dinâmicas de movimento. Os neurônios que sinalizam posições estáticas têm pequena somata e estão localizados distalmente. Estas células são tonicamente ativo. A joint PD contém apenas um único órgão chordotonal enquanto há dois órgãos chordotonal no carpo-própodo (PB) e merus-carpo (MC) articulações.
A dissecção de expor estruturas proprioceptivas em caranguejos azuis (C. sapidus) para a gravação eletrofisiológico requer uma estratégia que permite movimentos articulares a ter lugar nas posições naturais durante a gravação de neurônios sensoriais. O nervo para o músculo tensão abridor na perna curta é muito bom nervo composta por vários neurônios. A menos que se tenha o cuidado, o nervo tensão, bem como o nervo motor que inervam o músculo a ser estimulado, pode ser danificado durante o esvaziamento. Paragravações óptimas os eléctrodos de sucção têm de ser adaptados ao tamanho do nervo. As gravações são facilmente acessíveis em um laboratório estudante usando um de 30 40X microscópio ampliação de dissecação e micromanipuladores low-end.
Futuros experimentos que seriam interessantes para prosseguir com os órgãos chordotonal conjuntas seria examinar os perfis estruturais e fisiológicas durante a regeneração perna em várias espécies em diferentes fases do ciclo de vida como um acompanhamento para um estudo inicial que utilizou Cancer magister 19,26 . Perguntas restantes a serem abordados são: 1) que a distribuição e organização dos neurônios regenerados dependem da idade do animal quando regenerar um membro, 2) são as projeções axonais para o CNS (cordão nervoso ventral) em um galho de regeneração funcional ou o faz levar tempo e utilização conjunta para estabelecer conexões funcionais, e 3) o que acontece com os axônios cortados proximal ao plano autotomy quando o membro é autotomized? 28
Crustáceos estar de acordo com as condições ambientais e sua temperatura circundante, mas não está claro como eles manter a coordenação dentro de um circuito neural como neurônios alteram sua atividade em resposta a mudanças de temperatura. A baixa taxa de mudança pode permitir que o animal algum tempo para aclimatação ao passo que uma mudança rápida pode not29 de 30. As alterações fisiológicas no pH ou osmolaridade devido ao metabolismo, o comportamento de 31, ou o impacto ambiental pode apresentar desafios semelhantes aos circuitos neurais envolvidos na propriocepção. Estas preparações de crustáceos são ideais para enfrentar esses tipos de problemas, porque a sua função é bem caracterizado em um nível de uma única célula.
Neste protocolo, têm demonstrado a importância fisiológica dos neurônios tensão no monitoramento força gerada pelo músculo abridor. Esses receptores de tensão pode ser atribuída a sua localização dentro do apodeme usando procedimentos de coloração. Estesneurônios, como em mamíferos, detectar vigor em vários níveis e recrutar neurônios à medida que a força aumenta. A freqüência da atividade está relacionada com a freqüência de estimulação do neurônio motor até à saturação na recepção é atingido. Usando um protocolo de liberação rápida com a articulação dactylus flexionado, atividade tensão desaparece rapidamente, mas, em seguida, retorna após recuperar a tensão em uma joint totalmente estendida. Este é um procedimento experimental clássico para ilustrar a força medida pelos receptores de tensão. Vários neuromoduladores pode ser aplicado para a preparação ver como efetua o desenvolvimento de força e a resposta neuronal. Um dos aspectos importantes é a forma como as respostas neurais são processados e integrados no sistema nervoso central e o seu impacto sobre a actividade de neurónios motores. As técnicas que têm mostrado permitem começar a tratar mais informações sobre a tensão (sensorial) função do circuito neuronal do nervo motor, ou seja, sinal de uma perna intacta para o gânglio e de voltapara o músculo.
Os procedimentos de coloração demonstrados são a chave para a compreensão da fisiologia dos neurônios sensoriais que inervam órgãos proprioceptivos. Disposição anatómica dos neurónios baseados em função do tamanho e da soma são semelhantes em vários órgãos chordotonal dentro das pernas de caranguejo. Não se sabe se os arranjos neuronais semelhantes também são encontrados em outras espécies de crustáceos e insetos. Combinando gravações fisiológicas a partir de células individuais e mapear a localização permite relações de função estrutura direta. A preservação de longo prazo da disposição anatômica com CoCl 2 marcação e fixação permite repetidamente fazer medidas e avaliar o arranjo estrutural.
Propriocepção e recepção da tensão dos músculos do esqueleto são modalidades sensoriais que permitem comportamentos coordenadas e as respostas ao ambiente externo e interno para animais articulados em uma variedade de configurações do músculo esqueléticos. O órgão receptor muscular no abdômen do lagostim é uma outra preparação bem documentado (ver o Projeto Crawdad; http://www.crawdad.cornell.edu/ ) para fins de ensino de propriocepção com apenas dois neurônios por hemi-segmento abdominal 23 . Ser capaz de gravar a partir de neurônios individuais para feixes de nervos sensoriais fornece mais detalhes que ajudam na compreensão dos princípios básicos da recepção sensorial. Estas preparações de crustáceos relativamente simples permitem abordar aspectos fundamentais da propriocepção e monitoramento de tensão, com o potencial para determinar os circuitos neurais que permitem a integração centro de insumos proprioceptivos e outros sensoriais 9-12, 32, 33.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores são gratos pelas contribuições artísticas de Hyewon Cooper.
Materials
| Sylgard | Dow Corning | 182 silicone kit | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| KCl | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C5670 | |
| HEPES acid | Sigma | 3375 | Free acid, crystalline |
| HEPES base | Sigma | ||
| D-Glucose | Sigma | G7021 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma | M2643 | |
| Na2SO4•10H2O | Sigma | 246980 | |
| Bouin’s solution fixative | Sigma | HT10-1-32 | Caution: Hazardous material (Special shipping cost required) |
| CoCl2 | Sigma | Caution: Hazardous material. Please follow proper disposal according to local and federal regulations. | |
| Methylene blue chloride | Matheson Co., Inc | Basic Blue 9, C.I. 52015 | |
| 4-Di-2-ASP | Molecular Probes | 4-(4-diethylaminostyryl)-N-methylpyridinium iodide | |
| Bleach | Sigma-Aldrich | To chloride silver wire | |
| NaOH | Sigma-Aldrich | 221465 | To adjust pH |
| HCl | Sigma-Aldrich | H1758 | To adjust pH |
| Materials | |||
| Dissecting tools | World Precision Instruments | assortment | |
| Intracellular electrode probe | |||
| Faraday cage | |||
| Insect Pins | Fine Science Tools, Inc | 26001-60 | |
| Dissecting microscope (100X) | |||
| Fiber optic lamp | |||
| Small adjustable mirror | To direct light beam toward the preparation. | ||
| Glass electrodes | Sigma-Aldrich | CLS7095B5X | Box of 200, suction electrodes |
| Micromanipulator | World Precision Instruments | MD4-M3-R | Can fix for base or on a metal rod |
| Raised preparation stand | |||
| Silver wire (10/1,000 inch) | A-M Systems | 782500 | |
| Computer | Any company | ||
| AC/DC differential amplifier | A-M Systems | Model 3000 | |
| PowerLab 26T | AD Instruments | 27T | |
| Force transducer | AD Instruments | 0-50g | MLTF050/ST |
| Head stage | AD Instruments | Comes with AC/DC amplifier | |
| LabChart7 | AD Instruments | ||
| Electrical leads | Any company | ||
| Glass tools | Make yourself | For manipulating nerves | |
| Cable and connectors | Any company | ||
| Pipettes with bulbs | Fisher Scientific | 13-711-7 | Box of 500 |
| Beakers | Any company | ||
| Wax or modeling clay | Any company or local stores | ||
| Stimulator | Grass Instruments | SD9 or S88 | |
| Plastic tip for suction electrode | Local hardware store (Watt’s brand) | ¼ inch OD x 0.170 inch ID | Cut in small pieces. Pull out over a flame and cut back the tip to the correct size |
References
- Whitear, M. Chordotonal organs in Crustacea. Nature. 187, 522-523 (1038).
- Alexandrowicz, J. S. The comparative anatomy of leg propriocetors in some decapod Crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 52 (3), 605-634 (1972).
- Hartman, H. B., Boettiger, E. G. The functional organization of the propys-dactylus organ in Cancer irroratus Say. Comp. Biochem. Physiol. 22, 651-663 (1967).
- Cooper, R. L., Hartman, H. B. Responses of the bender apodeme tension receptors in the Dungeness crab, Cancer magister. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 109 (2), 479-486 (1994).
- Cooper, R. L. Mapping proprioceptive neurons on chordotonal organs in the crab, Cancer magister. Crustaceana. 81 (4), 447-475 (2008).
- Burke, W. An organ for proprioception and vibration sense in Carcinus maenas. J. Exp. Biol. 31, 127-138 (1953).
- Hill, A. V. . First and Last Experiments in Muscle Mechanics. , (1970).
- Stuart, D. G., Mosher, C. C., Gerlach, R. L., Reinking, R. M. Mechanical arrangement and transducing properties of Golgi tendon organs. Exp. Brain Res. 14 (3), 274-292 (1972).
- Macmillan, D. L., Dando, M. R. Tension receptors on the apodemes of muscles in the walking legs of the crab, Cancer magister. Mar. Behav. Physiol. 1 (1-4), 185-208 (1972).
- Bévengut, M., Simmers, A. J., Clarac, F. Central neuronal projections and neuromuscular organization of the basal region of the shore crab leg. J. Comp. Neurol. 221 (2), 185-198 (1983).
- El Manira, A., Cattaert, D., Clarac, F. Monosynaptic connections mediate resistance reflex in crayfish (Procambarus clarkii) legs. J. Comp. Physiol. A. 168 (3), 337-349 (1991).
- Le Bon-Jego, M., Cattaert, D. Inhibitory component of the resistance reflex in the locomotor network of the crayfish. J. Neurophysiol. 88 (5), 2575-2588 (2002).
- Ray, D. L., Clarac, F., Cattaert, D. Functional analysis of the sensory motor pathway of resistance reflex in crayfish. I. Multisensory coding and motor neuron monosynaptic responses. J. Neurophysiol. 78 (6), 3133-3143 (1997).
- Wiersma, C. A. G. Vergleichende Untersuchungenüber das periphere Nerve-muskelsystem von Crustaceen (Comparative studies on the peripheral nerve-muscle system of crustaceans). J. Comp. Physiol. 19, 349-385 (1933).
- Wiersma, C. A. G. Movement receptors in decapod crustacea. J. Mar. Biol. Assoc. U.K. 38 (01), 01-143 (1959).
- Hartman, H. B. Tension receptors on the closer muscle apodeme in the walking legs of the blue crab Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 157 (3), 355-362 (1985).
- Holsinger, R. . The effect of regional phenotypic differences of Procambarus clarkii opener muscle on sarcomere length, fiber diameter, and force development MSc thesis [dissertation]. , (2013).
- Parsons, D. W. The morphology and ultrastructure of tension receptors in the walking legs of the crab, Carcinus maenas. Cell Tissue Res. 211 (1), 139-149 (1980).
- Parsons, D. W. Responses and central interactions of tension receptors in the leg muscle of Carcinus. Comp. Biochem. Physiol. A Physiol. 72 (2), 391-399 (1982).
- Tryba, A. K., Hartman, H. B. Dynamic responses of series force receptors innervating the opener muscle apodeme in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Comp. Physiol. A. 180 (3), 215-221 (1997).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. I. The chordotonal organs in the legs of the shore crab, Carcinus meanas. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 245 (725), 291-325 (1962).
- Whitear, M. The fine structure of crustacean proprioceptors. II. The thoracico-coxal organs in Carcinus, Pagurus and Astacus. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B Biol. Sci. 248 (752), 437-456 (1965).
- Leksrisawat, B., Cooper, A. S., Gilberts, A. B., Cooper, R. L. Muscle Receptor Organs in the Crayfish Abdomen: A Student Laboratory Exercise in Proprioception. J. Vis. Exp. (45), e2323 (2010).
- Baierlein, B., Thurow, A. L., Atwood, H. L., Cooper, R. L. Membrane Potentials, Synaptic Responses, Neuronal Circuitry, Neuromodulation and Muscle Histology Using the Crayfish: Student Laboratory Exercises. J. Vis. Exp. (47), e2322 (2011).
- Delaney, K., Gelperin, A. Cerebral interneurons controlling fictive feeding in Limaxmaximus; I. Anatomy and criteria for re-identification. J. Comp. Physiol. A. 166, 297-310 (1990).
- Hartman, H. B., Cooper, R. L. Regeneration and molting effects on a proprioceptor organ in the Dungeness crab, Cancer magister. J. Neurobiol. 25 (5), 461-471 (1994).
- Hartman, H. B., Austin, W. D. Proprioceptor organs in the antennae of Decapoda Crustacea. J. Comp. Physiol. 81 (2), 187-202 (1972).
- Cooper, R. L. Development of sensory processes during limb regeneration in adult crayfish. J. Exp. Biol. 201 (Pt 11), 1745-1752 (1998).
- Chung, Y. -. S., Cooper, R. M., Graff, J., Cooper, R. L. The acute and chronic effect of low temperature on survival, heart rate and neural function in crayfish (Procambarus clarkii) and prawn (Macrobrachium rosenbergii) species. Open J. Mol. Int. Physiol. 2 (3), 75-86 (2012).
- Blundon, J. A. Effects of temperature and thermal history on neuromuscular properties of two crustacean species. J. Comp. Physiol. B. 158 (6), 689-696 (1989).
- Cooper, R. M., Schapker, H., Adami, H., Cooper, R. L. Heart and ventilatory measures in crayfish during copulation. Open J. Mol. Int. Physiol. 1 (3), 36-42 (2011).
- Bierbower, S. M., Cooper, R. L. The mechanistic action of carbon dioxide on a neural circuit and NMJ communication. Journal of Experimental Zoology. , (2013).
- Bierbower, S. M., Shuranova, Z. P., Viele, K., Cooper, R. L. Sensory systems and environmental change on behavior during social interactions. Brain Behav. 3 (1), 4-13 (2013).
