Isolement et culture de cellules endothéliales de la embryonnaire du cerveau antérieur
Summary
Cette vidéo montre une stratégie simple et fiable pour la préparation de cultures pures de cellules endothéliales de cerveau antérieur embryonnaire dans les 10-12 jours et sera utile pour la recherche axée sur de nombreux aspects de l'angiogenèse cérébrale.
Abstract
Cellules endothéliales du cerveau embryonnaires peuvent servir comme un outil important dans l'étude de l'angiogenèse et le développement neuro-vasculaire et les interactions. Les deux réseaux vasculaires du cerveau antérieur embryonnaire, la pie-mère et périventriculaire, sont distinctes dans l'espace et avoir des origines différentes et des modèles de croissance. Les cellules endotheliales à partir des réseaux vasculaires et la pie-mère périventriculaires ont des profils uniques d'expression génique et les fonctions. Nous présentons ici un protocole étape par étape pour l'isolement, la culture, et la vérification des populations pures de cellules endothéliales à partir du réseau vasculaire périventriculaire (PVECs) du cerveau antérieur embryonnaire (télencéphale). Dans cette approche, le télencéphale dépourvue de membrane pial obtenu à partir de 15 jours embryonnaires de souris est hachée, une digestion avec de la collagénase / dispase, et on disperse mécaniquement dans une suspension cellulaire unique. PVECs sont purifiés à partir de la suspension cellulaire en utilisant une sélection positive avec l'anticorps conjugué à anti-CD-31/PECAM-1 microbilles en utilisant une forte magnétiqueProcédé de séparation. Des cellules purifiées sont cultivées sur collagène 1 boîtes de culture revêtues dans endothéliale milieu de culture de cellules jusqu'à confluence, et en outre en subculture. PVECs obtenu avec ce protocole exposition pavé et en forme de fuseau phénotypes, comme visualisé par microscopie optique à contraste de phase et microscopie de fluorescence. Pureté des cultures Pvec a été créée avec des marqueurs de cellules endothéliales. Dans nos mains, cette méthode fiable et cohérente donne des populations pures de PVECs. Ce protocole bénéficiera des études visant à obtenir un aperçu mécanistes dans le cerveau antérieur angiogenèse, la compréhension des interactions de Pvec et croisées des entretiens avec les types de cellules neuronales et détient un énorme potentiel pour l'angiogenèse thérapeutique.
Introduction
L'angiogenèse, la neurogenèse et la migration neuronale sont des événements critiques dans le système nerveux central (SNC) le développement, la réparation et la régénération. Plusieurs études ont montré que les élégantes cellules endothéliales stimulent la prolifération neuronale et vice-versa grâce à la libération de facteurs solubles et par contact direct. Nous avons trouvé curieux que dans la majorité de ces études 1-3, tandis que progéniteurs neuronaux / cellules souches neurales sont isolées du cerveau embryonnaire, ils sont co-cultivées avec des cellules endothéliales de cerveau de l'adulte, d'autres sources de tissu adulte, ou avec des lignées de cellules endothéliales. Cela peut être dû à des difficultés techniques associées à l'isolement et la mise en culture des populations pures de cellules endothéliales de cerveau embryonnaire en partie. Cependant, l'angiogenèse, la neurogenèse, la migration neuronale et sont des événements simultanés qui se produisent dans des ordres de grandeur plus robuste dans le cerveau embryonnaire que dans le cerveau d'un adulte normal. Le réseau vasculaire périventriculaire du embryonic cerveau antérieur (télencéphale) provient d'un navire situé dans le ganglion basal ébauche et se développe sous la forme d'un gradient ordonnée de ventral à dorsal télencéphale par jour embryonnaire 11 (E11) 4,5. Ce plexus de vaisseaux du réseau vasculaire périventriculaire se distinguent des vaisseaux pie-mère basée sur les origines, la localisation anatomique, les modèles de croissance, et la régulation du développement 4,5. La direction de propagation du gradient de l'angiogenèse périventriculaire correspond à la pente transversale neurogenetic télencéphalique. Au sein du télencéphale, le gradient de l'angiogenèse périventriculaire et le gradient de migration des neurones GABA chevauchent tangentiellement dans l'espace ainsi 6. En ce qui concerne la synchronisation, le gradient de l'angiogenèse est l'avance de la pente et de GABA neurone neurogenetic gradient d'environ un jour. Ainsi, les cellules endothéliales périventriculaires sont spatialement et temporellement bien placés pour fournir des indices essentiels pour soutenir la neurogenèse et télencéphaliqueneuronale 4,6 de migration. Par conséquent, l'utilisation des cellules endothéliales périventriculaires embryonnaires dans des expériences de co-culture avec des progéniteurs et / ou des neurones neurones fournirait un modèle plus favorable pour l'étude des interactions neurovasculaires et le développement de nouvelles voies pour le traitement de maladies neurodégénératives ou une lésion cérébrale ischémique / traumatique.
Nous insistons sur l'importance d'éliminer la membrane pial, non seulement pour limiter la contamination des cellules épithéliales, mais aussi pour séparer les cellules endothéliales pie-mère qui sont moléculairement et fonctionnellement distincte de cellules endothéliales du réseau vasculaire périventriculaire 4,6 (de PVECs appelés à distinguer de la pie-mère EC) . Ici, nous décrivons la méthode que nous utilisons régulièrement dans notre laboratoire pour obtenir un rendement riche et pur de PVECs. Ces cellules endothéliales sont préparés à partir forebrains embryonnaires isolées à partir d'un simple clic de souris chronométrée enceinte. Ils peuvent être complétés, en sous-culture, et on les congèle avec succès vers le bas pour une utilisation future.
Protocol
Representative Results
Discussion
Pvec de sont physiologiquement plus pertinent que les cellules endothéliales cérébrales adultes et EC provenant d'autres sources de tissus pour des études portant sur les interactions neurovasculaires et avoir un potentiel thérapeutique aussi. Pour la préparation PVEC, il est essentiel début à la dissection de travailler rapidement pour obtenir une bonne viabilité puisque les cellules mortes peuvent se lier de manière non spécifique à microbilles CD31. En outre, si la suspension à cellule unique n'e…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par une Alliance nationale pour la recherche sur la schizophrénie et la dépression (NARSAD) Prix du jeune chercheur et les Instituts nationaux de la Santé accorder R01NS073635 AV.
Materials
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| glutamax | Life Technologies | 305050-061 | |
| tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soyabean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Vectashield Hardset Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Flouroscent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz surgical instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz surgical instrument | RS5611 |
References
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