العزلة والثقافة من الخلايا البطانية من الجنينية الدماغ المقدم
Summary
يوضح هذا الفيديو استراتيجية سهلة وموثوقة لإعداد الثقافات نقية من الخلايا البطانية من الدماغ الأمامي الجنينية داخل 10-12 يوما، وسوف يكون من المفيد للبحوث تركز على جوانب كثيرة من الأوعية الدموية الدماغية.
Abstract
الخلايا البطانية المخ الجنينية يمكن أن تكون بمثابة أداة هامة في دراسة الأوعية الدموية والتنمية وعائية عصبية والتفاعلات. شبكات الأوعية الدموية وهما من الدماغ الأمامي الجنينية، حنوني وحول البطينات الدماغية، ومميزة مكانيا ولها أصول مختلفة وأنماط النمو. الخلايا البطانية من شبكات الأوعية الدموية حنوني وحول البطينات الدماغية وفريدة من نوعها ملامح التعبير الجيني ووظائفها. هنا نقدم بروتوكول خطوة بخطوة لعزل والثقافة، والتحقق من السكان نقية من الخلايا البطانية من شبكة الأوعية الدموية المحيطة بالبطين (PVECs) من الدماغ الأمامي الجنينية (الدماغ الانتهائي). في هذا النهج، ومفروم الدماغ الانتهائي خالية من الغشاء حنوني تم الحصول عليها من يوم الجنينية 15 الفئران، يتفاعل مع كولاجيناز / dispase، وفرقت ميكانيكيا في تعليق خلية واحدة. يتم تنقيته PVECs من الايقاف الخلية باستخدام اختيار إيجابية مع الأجسام المضادة anti-CD-31/PECAM-1 مترافق لبلي باستخدام مغناطيسي قويطريقة الانفصال. الخلايا تنقيته يتم تربيتها على الكولاجين 1 الأطباق الثقافة المغلفة في البطانية مستنبت الخلايا حتى تصبح متكدسة ومزيد من subcultured. الحصول PVECs مع هذا البروتوكول المعرض الحصوه والمغزل على شكل الظواهر، كما تصور من قبل على النقيض من المرحلة المجهر الضوئي ومضان المجهري. تأسست نقاء الثقافات PVEC مع علامات الخلايا البطانية. في أيدينا، وهذه الطريقة بشكل موثوق وثابت تعطي السكان نقية من PVECs. وهذا البروتوكول الاستفادة من الدراسات التي تهدف إلى اكتساب رؤى الآلي في الدماغ الأمامي الأوعية الدموية، وفهم التفاعلات PVEC، ومحادثات عبر أنواع الخلايا العصبية مع ويحمل إمكانات هائلة لتكوين الأوعية الدموية العلاجية.
Introduction
الأوعية الدموية، والخلايا العصبية الهجرة العصبية هي الأحداث الحاسمة في الجهاز العصبي المركزي (CNS) التنمية والإصلاح والتجديد. وقد أظهرت العديد من الدراسات أن الخلايا البطانية أنيقة تحفيز انتشار العصبية والعكس بالعكس من خلال الافراج عن العوامل القابلة للذوبان وعن طريق الاتصال المباشر. وجدنا أنه من الغريب أنه في الغالبية العظمى من هذه الدراسات 1-3، في حين يتم عزل الأسلاف العصبية / الخلايا الجذعية العصبية من المخ الجنينية، وأنها cocultured مع الخلايا البطانية من الدماغ الكبار، الكبار مصادر الأنسجة الأخرى، أو مع خطوط الخلايا البطانية. وهذا قد يكون في جزء منه بسبب الصعوبات التقنية المرتبطة عزل وزراعة السكان نقية من الخلايا البطانية من المخ الجنينية. ومع ذلك، الأوعية الدموية، تكوين الخلايا العصبية، وهجرة الخلايا العصبية هي الأحداث المتزامنة التي تحدث في أوامر من حجم أكثر قوة في الدماغ الجنينية مما كانت عليه في الدماغ الكبار العادي. شبكة الأوعية الدموية المحيطة بالبطين من embryoniج الدماغ الأمامي (الدماغ الانتهائي) تنبع من سفينة تقع ضمن العقد القاعدية منشم ويتطور في شكل التدرج المنظم من بطني لالظهرية لل telencephalon بعد يوم الجنينية 11 (E11) 4،5. هذه الضفيرة من السفن من شبكة الأوعية الدموية المحيطة بالبطين تختلف عن السفن حنوني على أساس أصول والموقع التشريحي، وأنماط النمو، وتنظيم التنموية 4،5. اتجاه الانتشار من الأوعية الدموية المحيطة بالبطين مباريات متدرجة الانحدار العصبية الوراثية عرضية الدماغ الانتهائي. ضمن الدماغ الانتهائي، التدرج الأوعية الدموية المحيطة بالبطين والتدرج من الخلايا العصبية GABA المهاجرة تتداخل بشكل طفيف مكانيا كذلك 6. فيما يتعلق بالتوقيت، التدرج الأوعية الدموية في وقت مبكر من العصبية الوراثية الانحدار والخلايا العصبية GABA التدرج بنحو يوميا. وبالتالي، الخلايا البطانية حول البطينات الدماغية هي مكانيا وزمانيا في وضع جيد لتقديم العظة الحرجة لدعم تكوين الخلايا العصبية والدماغ الانتهائي4،6 هجرة الخلايا العصبية. ولذا، فإن استخدام الخلايا البطانية حول البطينات الدماغية الجنينية في التجارب coculture مع الأسلاف العصبية و / أو الخلايا العصبية تقدم نموذجا أكثر ملاءمة لدراسة التفاعلات الوعائية العصبية وتطوير سبل جديدة لعلاج المرض العصبي أو نقص تروية / إصابات في الدماغ.
فإننا نؤكد على أهمية إزالة الغشاء حنوني، وليس فقط للحد من تلوث الخلايا الظهارية ولكن أيضا لفصل الخلايا البطانية حنوني التي هي جزيئيا ومتميزة وظيفيا من الخلايا البطانية في الأوعية الدموية المحيطة بالبطين شبكة 4،6 (PVECs يطلق تمييزها عن حنوني ECS) . هنا، نحن تصف طريقة التي نستخدمها بشكل روتيني في مختبرنا للحصول على العائد غنية ونقية من PVECs. وتعد هذه الخلايا البطانية من forebrains الجنينية معزولة عن ماوس توقيت الحوامل واحد. أنها يمكن توسيعها، subcultured، وتجميد أسفل بنجاح لاستخدامها في المستقبل.
Protocol
Representative Results
Discussion
في PVEC هي أكثر أهمية من الناحية الفسيولوجية من الخلايا البطانية الكبار الدماغ وECS من مصادر الأنسجة الأخرى للدراسات تركز على التفاعلات الوعائية العصبية وأيضا لديها الإمكانات العلاجية. لإعداد PVEC، فمن بداية حاسمة مع تشريح للعمل بسرعة لتحقيق الجدوى جيدة منذ الخلايا الم?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل التحالف الوطني لأبحاث الفصام والاكتئاب (NARSAD) جائزة الباحث الشاب والمعاهد الوطنية للصحة منح R01NS073635 لAV.
Materials
| DNase I | Sigma | D-4527 | |
| Collagen, Type 1 solution from rat tail | Sigma | C3867 | |
| DPBS | Quality Biologicals | 114057-131 | |
| EDTA | Fisher Scientific | M4055 | |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| MS column | Miltenyi Biotech | 130-042-201 | |
| CD31 microbeads | Miltenyi Biotech | 130-097-418 | |
| MACS separator | Miltenyi Biotech | 130-042-102 | |
| MACS multi stand | Miltenyi Biotech | 130-042-303 | |
| Cell strainer 70 µm | BD Bioscience | 352350 | |
| Antibiotic and antimycotic solution | Sigma | A5955 | |
| FBS | Sigma | F4135 | |
| Collagenase/Dispase | Roche | 10269638001 | |
| DMEM | Lonza | 12-604F | |
| 35 mm culture dish | BD Bioscience | 353001 | |
| 15 ml falcon tube | BD Bioscience | 352097 | |
| 50 ml falcon tube | BD Bioscience | 352098 | |
| ECCM kit | BD Bioscience | 355054 | Kit Includes Endothelial cell growth supplement, EGF and Soybean Trypsin Inhibitor |
| Endothelial Cell Growth Supplement (ECGS) | BD Bioscience | 354006 | |
| RBECGM | Cell applications | R819-500 | |
| DMEM F12 | Life Technologies | 10565-018 | |
| glutamax | Life Technologies | 305050-061 | |
| tissue culture grade water | Life Technologies | 15230162 | |
| 0.25% Trypsin | Life Technologies | 15050 | |
| Soyabean trypsin inhibitor | BD Bioscience | 5425 | |
| Matrigel | BD Bioscience | 354234 | |
| Qtracker 655 Cell Labeling Kit | Life Technologies | Q25021 | |
| CellLight Plasma Membrane-RFP, BacMam 2.0 | Life Technologies | C10608 | |
| Biotinylated Isolectin B4 antibody | Sigma | L2140 | |
| Anti-Von Willebrand factor | Sigma | F3520 | |
| Anti-CD31/PECAM-1 | BD Pharmingen | 550274 | |
| Vectashield Hardset Mounting media with DAPI | Vector Laboratories | H-1500 | |
| Ketamine | Butler Schein Animal Health Supply | 44028 | |
| Xylazine | Lloyd Laboratories | 1009 | |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ-168 | |
| hemocytometer | Fisher Scientific | 267110 | |
| inverted microscope | Olympus CK-40 | CK-40 | |
| Flouroscent microscope | Olympus FSX-100 | FSX-100 | |
| Fine forceps | Roboz surgical instrument | 7 inox | |
| Fine microtip scissors | Roboz surgical instrument | RS5611 |
References
- Shen, Q., S, G., et al. Endothelial cells stimulate self-renewal and expand neurogenesis of neural stem cells. Science. 304, 1338-1340 (2004).
- Milner, R. A novel three-dimensional system to study interactions between endothelial cells and neural cells of the developing central nervous system. BMC Neurosci. 8, 3 (2007).
- Rauch, M. F., Michaud, M., Xu, H., Madri, J. A., Lavik, E. B. Co-culture of primary neural progenitor and endothelial cells in a macroporous gel promotes stable vascular networks in vivo. 19, 1469-1485 (2008).
- Vasudevan, A., Long, J. E., Crandall, J. E., Rubenstein, J. L., Bhide, P. G. Compartment-specific transcription factors orchestrate angiogenesis gradients in the embryonic brain. Nat. Neurosci. 11, 429-439 (2008).
- Vasudevan, A., Bhide, P. G. Angiogenesis in the embryonic CNS: a new twist on an old tale. Cell Adh. Migr. 2, 167-169 (2008).
- Won, C. K., et al. Autonomous vascular networks synchronize GABA neuron migration in the embryonic forebrain. Nat. Commun. 4, 2149-2162 (2013).
- Dong, Q. G., et al. A general strategy for isolation of endothelial cells from murine tissues. Characterization of two endothelial cell lines from the murine lung and subcutaneous sponge implants. Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 17, 1599-1604 (1997).
- Erblich, B., Zhu, L., Etgen, A. M., Dobrenis, K., Pollard, J. W. Absence of colony stimulation factor-1 receptor results in loss of microglia, disrupted brain development and olfactory deficits. PLoS One. 6, (2011).
- Wichterle, H., Garcia-Verdugo, J. M., Herrera, D. G., Alvarez-Buylla, A. Young neurons from medial ganglionic eminence disperse in adult and embryonic brain. 2, 461-466 (1999).
- Snapyan, M., et al. Vasculature guides migrating neuronal precursors in the adult mammalian forebrain via brain-derived neurotrophic factor signaling. J. Neurosci. 29, 4172-4188 (2009).
- Whitman, M. C., Fan, W., Rela, L., Rodriguez-Gil, D. J., Greer, C. A. Blood vessels form a migratory scaffold in the rostral migratory stream. J. Comp. Neurol. 516, 94-104 (2009).
