Erkennung von Live-<em> Escherichia coli</em> O157: H7-Zellen durch PMA-qPCR

Nachweis von E. coli O157: von qPCR mit ORF Z3276 H7 Einer der Schlüsselfaktoren für diesen Test ist die Sensitivität und Spezifität des Z3276 Sonde in der qPCR eingesetzt. Es kann als nur einige wenige Kopien des Genoms von DNA von E. erkennen coli O157: H7, wie in 1A gezeigt. Der 120 nicht-O157-Stämme untersucht, einschließlich der sechs großen nicht-O157 STEC-Stämme O104: H4-Stämme, Salmonella und Shigella-Stämme wurde keine Kreuzreaktivität festgestellt, wie in Tabelle 1 gezeigt. Die Kombination der Behandlung mit PMA qPCR Ausbrüten E. coli O157: H7-Zellen mit PMA (50 mM) für 5 min im Dunkeln und Belichten für 2 min wurden PMA Behandlungsbedingungen ausgewählt. Zusätzlich modifiziert wir PMA Behandlungsverfahren. Vergleich verschiedener transparenter Mikroröhrchen in dem Vernetzungsschritt verwendet wurde, wurde eine Platte mit 96 Vertiefungen gefunden, um effizienter zuerreichen die optimale Vernetzungseffekt und bequemer Handhabung einer großen Anzahl von Probenröhrchen während der Belichtungsprozess. Die Amplifikation von DNA aus PMA-behandelten lebenden und toten Zellen in qPCR Die Wirkungen von PMA-vermittelte Hemmung der Amplifikation von DNA aus toten Zellen in diesem Assay wurden qPCR in Fig. 1 durch die Verwendung von zwei seriellen 10-fachen lebenden oder toten Zellverdünnungen abgeleitete DNA gezeigt. Die Ergebnisse zeigen, dass die aus den lebenden Zellen mit PMA (rote Kurve) und ohne PMA (blaue Kurve) behandelt erzeugt Kurven scheinen linearen und nahezu identisch zueinander. Leichte CT Wertdifferenzen zwischen den lebenden Zellen, die mit PMA und ohne PMA (1A) behandelt, die vermuten lassen, dass PMA-Behandlung hatte wenig Einfluss auf die Amplifikation der DNA der lebenden Zellen in der qPCR. Aber ein 15 – CT-Wert-Differenz (32.000-fach) wurde zwischen der toten Zellen mit PMA behandelt und ohne PMA, Demo gezeigtnstrating dass PMA-Behandlung effizient unterdrückt DNA-Amplifikation von den toten Zellen (Abbildung 1B). Nachweis von lebenden Zellen von lebenden und toten Zellgemischen in qPCR Zwei Sätze von lebenden Zellen Verdünnungen (8 x 10 0 – 8 x 10 6 CFU) wurden mit oder ohne PMA PMA behandelt, um lebende Zellen von Live / Dead-Zellgemischen zu erkennen. Die Ergebnisse qPCR (2A) gezeigt, eine parallel inverse progressive Entwicklung der CT-Werte, um die Zahl der lebenden Zellen behandelt (lila Balken) auf die unbehandelten Proben (blaue Balken) bezogen. Die behandelten lebenden Zellen ergab eine etwas höhere CT-Werte als die der unbehandelten lebenden Zellen. Eine ähnliche inverse progressive Tendenz in CT-Werte wurde mit der realen Zahl der lebenden Zellen in den mit PMA (grüne Balken) in 2B behandelt sowie Live / Dead-Zellgemischen beobachtet. Zusätzlich sind Abwärtstrend der CT-Werte wartrotz der Anwesenheit von 106 toten Zellen mit der Anzahl lebender Zellen in der Mischung beobachtet. Diese Ergebnisse zeigten, daß die CT-Werte der lebenden / toten Zellgemischen dargestellt DNA aus den lebenden Zellen alleine, während der DNA-Amplifikation aus den toten Zellen effizient durch PMA-Behandlung unterdrückt. Aber die CT-Werte von Live mit PMA behandelt / tote Zelle Mischungen wurden schwankte und es versäumt, reflektiert die Live-Zahlen Zelle in den Mischungen in 2B (gelbe Balken). Fig. 1 ist. Lebenden und toten Zellen mit PMA oder ohne PMA in qPCR-Assay behandelt. (A) Eine Serie von 10-fach verdünnte Live E. coli O157: H7 Zelle Verdünnungen (8 x 10 0 – 8 x 10 6 CFU) wurden mit PMA oder ohne PMA behandelt.Die CT-Werte stellen die Mittelwerte der CT dreifach in der qPCR-Assays. (B) Vergleich der DNA-Amplifikation von lebenden und toten Zellen mit PMA und ohne PMA in der q Vergleich qPCR-Assay behandelt. ΔRn bezieht sich auf Intensitätsänderung der Fluoreszenz. Klicken Sie hier für eine größere Ansicht. 2. Differenzierung von lebenden Zellen von lebenden / toten Zellgemischen durch PMA-qPCR Vier Sätze von 10-fachen Verdünnungen von Zellkulturen (8 x 10 0 – 8 x 10 6 CFU). Wurden wie angegeben. (A) Erste Reihe von Zellverdünnung wurde mit PMA behandelt, während die zweite Zelle Verdünnung war oder unbehandelt, bevor die DNA-Extraktion.(B) 8 x 10 6 Tote Zellen wurden mit den dritten und vierten Sätzen von Zellen Verdünnungen vermischt, um zwei Sätze von lebenden / toten Zellgemische stellen, wie angegeben. Ein Satz der Zellgemische wurden mit PMA behandelt und die andere Gruppe wurde ohne PMA vor der DNA-Extraktion behandelt. Jeder Balken stellt den Mittelwert CT-Werte eines Dreifachversuch ± SD. Organismus Serotyp Anzahl der getesteten Stämme E. coli 2006 Spinat O157: H7 Ausbruch Isolate 186 2006 Taco Bell O157: H7-Isolate 58 2006 Taco John O157: H7-Isolate 11 DMB Stammsammlungen von anderen O157: H7 Ausbrüche 112 O104: H4 3 O26 18 O103 13 O111 24 O121 2 O45 5 O145 9 O113 2 O91 1 O55 9 Andere 19 Salmonellen Typhi 1 Newport 2 Shigella dysenteriae 6 2 Shigella sonnei Unbekannt 2 Shigella flexneri 4 1 Shigella boydii 1 1 Gesamt 481 TLage ein. Stämme für die Validierung in Echtzeit PCR-Test für die Identifizierung von E. verwendet coli O157: H7.