الكشف عن لايف<em> كولاي</em> O157: H7 من قبل خلايا PMA-QPCR
Summary
وقد تم تطوير فحص للكشف عن QPCR كولاي O157: H7 استهداف علامة جينية فريدة، Z3276. تم الجمع بين QPCR مع propidium monoazide (سلطة النقد الفلسطينية) العلاج للكشف عن الخلية الحية. تم تعديل هذا البروتوكول وتتكيف مع شكل لوحة 96 جيدا لسهولة ومتسقة التعامل مع عينات عديدة
Abstract
فريد إطار القراءة المفتوح تم تحديد (ORF) Z3276 كعلامة وراثية محددة لE. O157 كولاي: H7. وقد تم تطوير فحص للكشف عن QPCR E. كولاي O157: H7 من خلال استهداف ORF Z3276. مع هذا الاختبار، ونحن يمكن الكشف منخفضة تصل إلى بضع نسخ من جينوم الحمض النووي من E. O157 كولاي: H7. وتأكدت حساسية وخصوصية الفحص عن طريق اختبارات التحقق من صحة مكثفة مع عدد كبير من E. كولاي O157: H7 سلالات (ن = 369) وسلالات غير O157 (ن = 112). وعلاوة على ذلك، ونحن تضافرت propidium monoazide (سلطة النقد الفلسطينية) الإجراء مع بروتوكول QPCR وضعت حديثا للكشف الانتقائي للخلايا الحية من الخلايا الميتة. التضخيم من الحمض النووي من الخلايا الميتة سلطة النقد الفلسطينية المعاملة كانت تحول دون بالكامل تقريبا على النقيض من التضخيم تتأثر تقريبا من الحمض النووي من الخلايا الحية سلطة النقد الفلسطينية المعاملة. بالإضافة إلى ذلك، تم تعديل البروتوكول وتتكيف مع شكل لوحة 96 جيدا لسهولة التعامل ويتفق عدد كبير من العينات. Tومن المتوقع أن يكون لها تأثير على الميكروبيولوجية دقيقة والرصد الوبائي لسلامة الأغذية ومصدر بيئي طريقته.
Introduction
PCR هي تقنية شائعة للكشف عن E. كولاي O157: H7 من العينات الغذائية والبيئية. تحديد المؤشرات الحيوية محددة لE. كولاي O157: H7 هي واحدة من العوامل الرئيسية لنجاحها في الكشف عن المقايسات PCR. المؤشرات الحيوية التي تستخدم عادة في المقايسات PCR للكشف عن E. كولاي O157: H7 تشمل السموم شيغا (STX 1 و 2 STX) 1،2، 3،4 uidA، eaeA 5،6، rfbE 7، وفليك الجينات 8،9. ويمكن لهذه المؤشرات الحيوية توفير الكفاءة لتحديد متغير، ومع ذلك، فإن معظم المؤشرات الحيوية لا يمكن أن تستخدم العلامات البيولوجية فريدة من نوعها للكشف عن E. O157 كولاي: H7. هذا القصور في السلطة التفريق بين الجينات المستهدفة يدعو العلامات البيولوجية أكثر تحديدا وأقوى (ق) لتحديد E. O157 كولاي: H7 10.
تحقيقات عديدة للجينات أو إطارات القراءة المفتوحة افتراضية (ORFS) في E. القولونيةO157: H7 تم تصميمها ل11 QPCR مقايسة على أساس القرائن من ميكروأرس التنميط الجيني DNA من مختبرنا وخلال البحث في قاعدة بيانات بنك الجينات من المركز الوطني لمعلومات التكنولوجيا الحيوية. وقد تم اختيار تسلسل Z3276 ORF، وهو الجين خملي 11، لQPCR الفحص. بعد ذلك، تم تطوير فحص QPCR من خلال العديد من التجارب على المعلمات PCR مثل تركيزات الاشعال وتحقيقات، فضلا عن الصلب والإرشاد درجات الحرارة (لا تظهر البيانات). بعد الشمولية والتفرد حافز اختبارات على السلالات المرجعية مثل E. كولاي O157: H7، غير O157 والشيجلا سلالات في QPCR، تم التعرف على ORF Z3276 كعلامة وراثية محددة وقوية لتحديد E. O157 كولاي: H7. ثم نطور طريقة جديدة باستخدام QPCR هذه العلامات البيولوجية فريدة لتحديد E. O157 كولاي: H7.
تحد آخر في الكشف عن E. كولاي O157: H7 في الملوثة FOالمواد المستنفدة للأوزون والبيئة هو تحديد دقيق للخلايا الحية من العينات. وجود مدد من الحمض النووي من الخلايا الميتة وعدم القدرة على التفريق الجدوى في فحص PCR يمكن أن يسبب قراءات إيجابية كاذبة، مما أدى إلى المبالغة في تقدير أعداد الخلايا الحية في الكشف. بالتالي، وهذا يحد من استخدام PCR في الكشف عن مسببات الأمراض المنقولة عن طريق الأغذية دقيقة 12. وقد اتخذت نهجا جديدا للتمييز الحمض النووي من الخلايا الميتة من خلال الجمع بين propidium monoazide (سلطة النقد الفلسطينية) العلاج مع إجراء PCR في السنوات القليلة الماضية 13-15. سلطة النقد الفلسطينية قادرة على الذهاب إلى الداخل من الخلايا الميتة، ويقحم في الحمض النووي عند تعرضها للضوء، ولكن لا يمكن أن تذهب داخل الخلايا الحية لتتفاعل مع الحمض النووي للخلايا الحية. وهكذا، في خليط من سلطة النقد الفلسطينية المعاملة من الخلايا الحية والميتة، والحمض النووي من خلايا ميتة لا يمكن تضخيم PCR في 13. نحن الجمع بين العلاج مع سلطة النقد الفلسطينية QPCR مقايسة وضعت حديثا للكشف عن انتقائي الحية E. كولاي O157: H7 الخلايا. بالإضافة إلى ذلك، حققنا سلطة النقد الفلسطينية، وQPCRssay ممكن للكشف عن إنتاجية عالية.
Protocol
Representative Results
Discussion
والهدف الأساسي من هذه الدراسة تنطوي على استخدام لORF Z3276، وهي فريدة من نوعها لE. كولاي O157: H7، والعلامات البيولوجية الوحيد لQPCR الفحص. في الوقت الحاضر، فإن معظم المقايسات QPCR تستهدف الجينات الفوعة، مثل stx1، stx2، وeaeA 1،2،5،6 أو الجينات المظهرية المشتركة، مثل uidA 3،4، rfbE والجينات فليك 8،9. في بعض الأحيان، وهي من الأنواع أو السلالة لا يمكن تحديدها بالتأكيد بواسطة الجينات الفوعة (ق)، مثل STX 1and STX 2 الجينات، كما هي موجودة في الأنواع أو السلالات المختلفة 16 وكذلك تلك الجينات. باستخدام rfbE وفليك عن الجينات المستهدفة، وهناك حاجة إلى كل من الجينات لاستخدامها في هوية كاملة 17. باستخدام ORF Z3276 والعلامات البيولوجية، وقد تجلى هذا الاختبار QPCR أن يكون الفحص حساسة ومحددة (الجدول 1). وقد تعرض هذا الاختبار لصرامة الشمولية والتفرد الاختبارات، بما في ذلك O157: H7 سلالات (ن = 367)، أكثر من 100 السلالات غير O157، والأنواع المسببة للأمراض الأخرى، مثل السالمونيلا والشيجلا. تم الكشف عن H7 سلالات درست بشكل إيجابي، وعثر على عدم تفاعل عرضية من سلالات غير O157 (الجدول 1)، مشيرا إلى أن ORF Z3276 هي العلامات البيولوجية فريدة وقوية للكشف عن E.: جميع O157 O157 كولاي: H7.
الهدف الآخر من هذه الدراسة هو الكشف عن انتقائي الخلايا الحية من الخلايا الميتة عن طريق العلاج قبل سلطة النقد الفلسطينية استخراج الحمض النووي. سلطة النقد الفلسطينية يمكن أن تخترق الخلايا الميتة مع غشاء للخطر وربط الحمض النووي، وبالتالي يحول دون تضخيم الحمض النووي من الخلايا الميتة في PCR 13. قمنا بتعديل الإجراء سلطة النقد الفلسطينية المعاملة، وتكييفه لشكل لوحة 96 جيدا لهذا الإجراء. كثافة حق التعرض للضوء هو ضروري للحصول على أفضل تأثير عبر ربط. سابقا، وقد استخدمت في هذه الخطوة microtubes 13-15. ومع ذلك، microtubes منفصلة يصعب التعامل معها في ضوء السابقينالخطوة posure، وهذه الأنابيب ليست شفافة تماما للحصول على أفضل تروق الصليب. باستخدام لوحة 96 جيدا، قمنا بتحسين كفاءة PMA-العلاج. هذه التغييرات قد تؤثر على الفحص في عدة طرق: أنها تجعل من السهل للحصول على تأثير ربط عبر شاملة وموحدة، وخاصة مع عينات عديدة؛ يمكن نقل عينات المعالجة من لوحة إلى أخرى لتجعل من الممكن للكشف عن عدد كبير العينات، وأنها توفر هذا الاختبار PMA-QPCR مع إمكانات أتمتة العملية برمتها ل. الحد من هذا الاختبار PMA-QPCR هو أن سلطة النقد الفلسطينية العلاج يزيد من تكلفة فحص PCR نوعا ما وانخفاض طفيف حساسية فحص PCR.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر وزارة الامن الداخلي الامريكية لتوفير جزء من التمويل.
Materials
| AB 7900HT Fast Real-time PCR system | ABI | ||
| 2 x Universal master mix | ABI | 4304437 | |
| PrepMan Ultra | ABI | 4318930 | |
| Primer Express | ABI | ||
| Probes | ABI | Top of Form | |
| 4316033 Bottom of Form | |||
| PMA | Biodium | 40013 | |
| Puregen cell and tissue kit | Qiagene | Top of Form | |
| 158622 | |||
| Bottom of Form | |||
| DU530 spectrophotometer | Beckman | ||
| Spectrophotometer | NanoDrop Technology | ND-1000 | |
| 650 w halogen light source | Britek | H8061S | |
| Otptical Adhesive film | ABI | 4311971 | |
| Optical 96-well reaction plate | ABI | 4316813 |
References
- Barletta, F., et al. Validation of five-colony pool analysis using multiplex real-time PCR for detection of diarrheagenic Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 47, 1915-1917 (2009).
- Gannon, V. P., King, R. K., Kim, J. Y., Thomas, E. J. Rapid and sensitive method for detection of Shiga-like toxin-producing Escherichia coli in ground beef using the polymerase chain reaction. Appl. Environ. Microbiol. 58, 3809-3815 (1992).
- Cebula, T. A., Payne, W. L., Feng, P. Simultaneous identification of strains of Escherichia coli serotype O157:H7 and their Shiga-like toxin type by mismatch amplification mutation assay-multiplex PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 248-250 (1995).
- Li, Y., Mustapha, A. Simultaneous detection of Escherichia coli O157:H7, Salmonella, and Shigella in apple cider and produce by a multiplex PCR. J. Food. Prot. 67, 27-33 (2004).
- Schmidt, H., et al. Differentiation in virulence patterns of Escherichia coli possessing eae genes. Med. Microbiol. Immunol. 183, 23-31 (1994).
- Fratamico, P. M., Sackitey, S. K., Wiedmann, M., Deng, M. Y. Detection of Escherichia coli O157:H7 by multiple PCR. J. Clin. Microbiol. 33, 2188-2191 (1995).
- Desmarchelier, P. M., Bilge, S. S., Fegan, N., Mills, L., Vary, J. C., Tarr, P. I. A PCR specific for Escherichia coli O157 based on the rfb locus encoding O157 lipopolysaccharide. J. Clin. Microbiol. 36, 1801-1804 (1998).
- Fields, P. I., Blom, K., Hughes, H. J., Helsel, L. O., Feng, P., Swaminathan, B. Molecular characterization of the gene encoding H antigen in Escherichia coli and development of a PCR-restriction fragment length polymorphism test for identification of E. coli O157:H7 and O157:NM. J. Clin. Microbiol. 35, 1066-1070 (1997).
- Fricker, M., Messelhäußer, U., Bushch, U., Scherer, S., Ehling-Schulz, M. Diagnostic real-time PCR assays for detection of emetic Bacillus cereus strains in foods and recent food-borne outbreaks. Appl. Environ. Microbiol. 73, 1892-1898 (2007).
- Li, B., Chen, J. Q. Real-time PCR methodology for selective detection of viable Escherichia coli O157:H7 cells by targeting Z3276 as a genetic marker. Appl Environ. Microbiol. 78, 5297-5304 (2012).
- Perna, N. T., et al. Genome sequence of enterohaemorrhagic Escherichia coli O157:H7. Nature. 409, 529-533 (2001).
- Wang, S., Levin, R. E. Discrimination of viable Vibrio vulnificus cells from dead cells in real-time PCR. J. Microbiol. Methods. 64, 1-8 (2006).
- Nocker, A., Cheung, C. Y., Camper, A. K. Comparison of propidium monoazide with ethidium monoazide for differentiation of live vs. dead bacteria by selective removal of DNA from dead cells. J. Microbiol. Methods. 67, 310-320 (2006).
- Nocker, A., Sossa-Fernandez, P., Burr, M. D., Camper, A. K. Use of propidium monoazide for live/dead distinction in microbial ecology. Appl. Environ. Microbiol. 73, 5111-5117 (2007).
- Cawthorn, D. M., Witthuhn, R. C. Selective PCR detection of viable Enterobacter sakazakii cells utilizing propidium monoazide or ethidium bromide monoazide. J. Appl. Microbiol. 105, 1178-1185 (2008).
- Chassagne, L., Pradel, N., Robin, F., Livrelli, V., Bonnet, R., Delmas, J. Detection of stx1, stx2, and eae genes of enterohemorrhagic Escherichia coli using SYBR Green in a real-time polymerase chain reaction. Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 64, 98-101 (2009).
- Liu, Y., Gilchrist, A., Zhang, J., Li, X. F. Detection of viable but nonculturable Escherichia coli O157:H7 bacteria in drinking water and river water. Appl. Environ. Microbiol. 74, 1502-1507 (2008).
