Bone Marrow-afgeleide macrofagen Productie
Summary
Macrofagen zijn lang erkend als een kritische component van het aangeboren en adaptieve immuunsysteem. De recente explosie van kennis met betrekking tot evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van de interactie tussen macrofagen en microben heeft wetenschappelijke aandacht vernieuwd macrofagen. Dit artikel beschrijft een methode om macrofagen te onderscheiden van muizen beenmerg.
Abstract
Macrofagen zijn kritische componenten van het aangeboren en adaptieve immuunrespons, en zij zijn de eerste lijn van verdediging tegen vreemde indringers vanwege hun krachtige microbicidal activiteiten. Macrofagen zijn ruim verdeeld door het lichaam en in de lymfoïde organen, lever, longen, maagdarmkanaal, centraal zenuwstelsel, botten en huid. Door hun verdeling, zij aan diverse fysiologische en pathologische processen. Macrofagen zijn zeer veelzijdig cellen die in staat zijn de micro-omgeving veranderingen herkennen en om weefsel homeostase te behouden zijn. Vele pathogenen mechanismen ontwikkeld om macrofagen als Trojaanse paarden overleven repliceren en infecteren mens en dier en verspreiden door het hele lichaam. De recente explosie van interesse in evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van gastheer-pathogeen interacties heeft wetenschappelijke aandacht met betrekking tot macrofagen vernieuwd. Hier beschrijven we eenprocedure voor het isoleren en kweken van murine macrofagen beenmerg dat grote aantallen macrofagen zal voor het bestuderen gastheer-pathogeen interacties en andere processen.
Introduction
Een belangrijk aspect van macrofagen is hun rol bij aangeboren en adaptieve immuniteit. Vanwege hun vermogen om inerte deeltjes, bacteriën of parasieten fagocyteren, macrofagen zijn een eerste lijn van verdediging tegen vreemde indringers. Eenmaal geïnternaliseerd, zijn microben afgebroken binnen phagolysosomes. Macrofagen ook werving signalen voor en presenteren antigenen sturen naar andere afweercellen, zoals T-lymfocyten. Macrofagen zijn afgeleid van monocyten. Monocyten ontstaan in het beenmerg van myeloïde stamcellen en migreren naar perifere bloed en diverse weefsels waar ze differentiëren tot macrofagen. Geschat wordt dat een gezonde volwassen muis bevat ongeveer 10 8 macrofagen die zijn verdeeld over het lichaam in diverse organen en weefsels (Tabel 1) 1.2. Macrofagen weer grote fenotypische en functionele diversiteit vanwege hun vermogen aan te passen aan hun micromilieu 3,4. De belangrijkste macrophage eigenschap is hun microbicide activiteit, die wordt gedefinieerd door hun vermogen om microben fagocyteren en vernietigen. De fagocytische wordt gedefinieerd door de activering van complexe signaalnetwerken die worden gestimuleerd door microbiële contact, dus macrofagen moduleren genexpressie adequaat in reactie op verschillende stimuli. Na fagocytose worden geëlimineerd microben in een structuur die de fagolysosoom, maar hebben veel pathogene microben strategieën ontwikkeld om de microbicide werking van de macrofagen 5 ondermijnen. De diversiteit van subversie mechanismen die worden gebruikt door verschillende microbiële species is een bewijs van de complexiteit van het proces fagocytaire 6 en fagolysosoom biogenese. Infectieziekten zijn belangrijke problemen voor de volksgezondheid, en tal van mechanismen en moleculen deelnemen aan macrofaag antimicrobiële activiteiten. Verder zijn de doelstellingen van de microbicidal eigenschappen die worden gekaapt door microben blijven onbekend, dus is er een eXplosion van belang in de evolutionaire, genetische en biochemische aspecten van gastheer-pathogeen interacties die wetenschappelijke aandacht met betrekking tot macrofagen heeft vernieuwd. Momenteel wordt het grootste deel van het onderzoek in het veld gedaan op macrofagen cellijnen, die verschillen van primaire macrofagen in de fagocytoseactiviteit, de cytokinen productie en de regulering van de oxidatieve burst. Bovendien zijn ze minder geschikt voor microscopie. Om de interactie macrofagen-pathogenen te onderzoeken is het aanbevolen om de primaire macrofagen, zoals beenmerg afgeleide macrofagen (BMDMs), die meer fysiologische kenmerken vertonen gebruiken. Bovendien is het mogelijk om te werken aan genetisch gemodificeerde BMDMs, omdat deze direct macrofagen kunnen worden geïsoleerd uit transgene muizen en, met de beschikbaarheid van nieuwe technologieën zoals lentivirale transfectie hun genexpressie profiel kan worden veranderd door overexpressie van de genen of RNA interferentie. Hier beschrijven we een werkwijze murine bone m differentiërenpijl in macrofagen die grote aantallen macrofagen zal 7 dagen voor verschillende functionele analyses uitgevoerd, zoals proteomics 7, transcriptomics 8, intracellulair verkeer bestudeert 9, dynamische studies 10, genetische screens (RNAi) en drug screening 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
De hierin beschreven protocol detailleert een methode om grote aantallen BMDMs produceren. BMDM primaire cellen en de biologische werking en eigenschappen van macrofagen gedifferentieerd uit monocyten omdat er volwassen, in tegenstelling tot macrofaag cellijnen die onvolwassen zijn. BMDMs kunnen worden gebruikt voor genetische screening (RNAi), drug discovery, functionele studies, gastheer-pathogeen interactie studies en vele andere gebieden van onderzoek.
De hierin voorgestelde procedure is…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door het CNRS (PICS 2012-2014 naar EG) en door een subsidie van Regione Campania (LR n.5, 28.03.2002 om Giovanna Mottola). Filippo Conti is een fellow van de wetenschappelijke samenwerking Stichting'' Infectiopole Sud.'' Nicola Boucherit is een fellow van het Franse Ministerie van Onderzoek en Technologie. De financieringsbronnen had geen rol in de onderzoeksopzet, dataverzameling, data-analyse, besluit tot publicatie of manuscript voorbereiding.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. . Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. . Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
