מח עצם נגזרות Macrophage הפקה
Summary
המקרופאגים כבר מזמן מוכרים כמרכיב קריטי של תגובות חיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות. הפיצוץ האחרון של ידע הנוגע להיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של האינטראקציה בין מקרופגים וחיידקים חידש את תשומת לב מדעית למקרופאגים. מאמר זה מתאר שיטה להבדיל מקרופאגים ממח העצם של עכבר.
Abstract
המקרופאגים הם רכיבים קריטיים של תגובות חיסון המולדת ובעלי כושר הסתגלות, והם קו הגנה הראשון נגד פולשים זרים בשל פעילות microbicidal החזקה שלהם. המקרופאגים מופצים באופן נרחב בכל הגוף ונמצאים באיברים הלימפה, כבד, ריאות, מערכת עיכול, מערכת עצבים מרכזית, עצם, ועור. בגלל חלוקה מחודשת שלהם, הם משתתפים במגוון רחב של תהליכים פיסיולוגיים ופתולוגיים. המקרופאגים הם תאים תכליתיים מאוד שהם מסוגלים לזהות שינויי microenvironmental ולשמור על הומאוסטזיס רקמות. פתוגנים רבים התפתחו מנגנונים להשתמש מקרופאגים כמו סוסים טרויאניים כדי לשרוד, לשכפל, ולהדביק גם בני אדם ובעלי חיים ולהפיץ בכל הגוף. הפיצוץ האחרון של עניין בהיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן חידש את תשומת לב מדעית לגבי מקרופאגים. כאן, אנו מתאריםהליך לבודד ולטפח מקרופאגים ממח עצם עכברי שיספק מספר גדול של מקרופאגים לחקר אינטראקציות בין המאכסן לפתוגן, כמו גם תהליכים אחרים.
Introduction
היבט משמעותי של תפקוד מקרופאג הוא תפקידם בחסינות מולדת ובעלי כושר הסתגלות. בגלל היכולת שלהם phagocytose חלקיקים, חיידקים או טפילי אינרטי, מקרופאגים הם קו הגנה ראשון נגד פולשים זרים. הפנים פעם, חיידקים מפורקים בתוך phagolysosomes. המקרופאגים גם לשלוח אותות גיוס ולאנטיגנים הווה לתאים אחרים של מערכת חיסון, כגון לימפוציטים מסוג T. המקרופאגים נגזרים ממונוציטים. מונוציטים מתעוררים במח עצם מתאי גזע מיאלואידית ולהגר לדם היקפי ורקמות שונות שבו הם להתמיין מקרופאגים. הערכה היא כי בעכבר בוגר ובריא מכיל כ 10 8 מקרופאגים שמופצים בכל הגוף באיברים שונים ורקמות (טבלה 1) 1,2. המקרופאגים להציג פנוטיפי גדול ומגוון תפקודי בגלל היכולת שלהם להסתגל ל3,4 microenvironment שלהם. Macrop החשוב ביותררכוש Hage הוא פעילות microbicidal שלהם, אשר מוגדרת על ידי היכולת שלהם phagocytose חיידקים ולהשמיד אותם. תגובת phagocytic מוגדרת על ידי ההפעלה של רשתות איתות מורכבות שהם מגורה על ידי מגע של חיידקים, ולכן, מקרופאגים לווסת ביטוי גנים כראוי בתגובה לגירויים שונים. לאחר phagocytosis, חיידקים בוטלו במבנה שנקרא phagolysosome, עם זאת, רבים חיידקים פתוגניים פיתחו אסטרטגיות לערער את תפקוד microbicidal של מקרופאגים 5. המגוון של מנגנוני חתרנות שמנוצלים על ידי מינים של חיידקים שונים הוא עדות למורכבות תהליך phagocytic 6 וphagolysosome biogenesis. מחלות זיהומיות הן בעיות בריאות אדם גדולות, ומספר רבים של מנגנונים ומולקולות להשתתף בפעילויות מיקרוביאלית מקרופאג. יתר על כן, המטרות של מאפייני microbicidal שנחטפו על ידי חיידקים אינן ידועות, ולכן, יש דוארxplosion עניין בהיבטים אבולוציוניים, גנטיים, והביוכימי של אינטראקציות בין מאכסן לפתוגן שחדש את תשומת לב מדעית לגבי מקרופאגים. נכון לעכשיו, מרבית המחקר בתחום נעשה על שורות תאי מקרופאגים, אשר נבדלות ממקרופאגים העיקריים בפעילות phagocytic, ייצור ציטוקינים והרגולציה של פרץ חמצוני. בנוסף, הם פחות מתאימים למיקרוסקופ. כדי לחקור את מקרופאגים-פתוגנים האינטראקציה מומלץ להשתמש מקרופאגים עיקריים, כגון המקרופאגים מח העצם נגזרו (BMDMs), שמפגינים תכונות פיסיולוגיות יותר. יתר על כן, זה אפשרי לעבוד על BMDMs מהונדס גנטי, כי מקרופאגים אלו עשויים להיות מבודדים ישירות מעכברים הטרנסגניים ו, עם הזמינות של טכנולוגיות חדישות כגון transfection lentiviral, פרופיל ביטוי הגנים שלהם ניתן לשנות על ידי ביטוי יתר של גן או התערבות RNA. כאן אנו מתארים הליך להבדיל מ 'עצם Murineחץ לתוך מקרופאגים שיספק מספר גדול של מקרופאגים ב -7 ימים לשונים פונקציונלי ניתוחים כגון פרוטאומיקה 7, transcriptomics 8, סחר תאיים מלומד 9 מחקרים, דינמיים 10, מסכי גנטיים (RNAi) וסמי הקרנת 11.
Protocol
Representative Results
Discussion
הפרוטוקול המתואר במסמך זה מפרט את שיטה להפקת כמויות גדולות של BMDMs. BMDM הם תאים ראשוניים ויש לי את הפונקציה ותכונות של מקרופאגים מובחנים ממונוציטים ביולוגיים כי יש בוגרים, בניגוד לשורות תאי מקרופאג, שהם לא בשלים. BMDMs עשוי לשמש לסינון גנטי (RNAi), הקרנת סמים, מחקרים פונקציונ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי CNRS (PICS 2012-2014 לEG) ועל ידי מענק מRegione קמפניה (n.5 LR, -28.03.2002 לג'ובאנה מוטולה). פיליפו קונטי הוא בחור של שיתוף הפעולה המדעי קרן'' Infectiopole Sud.'' ניקולה Boucherit הוא עמית של המשרד הצרפתי למחקר וטכנולוגיה. היו מקורות המימון לא היה תפקיד בעיצוב המחקר, איסוף נתונים, ניתוח נתונים, החלטה לפרסם, או הכנת כתב יד.
Materials
| Name of Material/Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| DMEM | Gibco Life Technologies | 21969-035 | |
| Fetal Calf Serum | Gibco Life Technologies | 10270 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco Life Technologies | 15070 | |
| Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-024 | |
| PBS (10x) | Lonza | BEM515F | |
| Red Blood Cell Lysis buffer | Sigma | R7757 | |
| Cell strainer 70 μm Nylon | BD Falcon | 352350 | |
| Cell strainer 40 μm Nylon | BD Falcon | 352340 | |
| 50 ml tubes | any supplier | n/a | |
| 15 ml tubes | any supplier | n/a | |
| Petri dishes (100/20 mm) | any supplier | n/a | culture treated |
| Petri dishes (35/10 mm) | any supplier | n/a |
References
- Rutherford, M. S., Witsell, A., Schook, L. B. Mechanisms generating functionally heterogeneous macrophages: chaos revisited. J. Leukocyte Biol. 53, 602-618 (1993).
- Van Furth, R., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. . Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).
- Adams, D., Halmiton, T., Gallin, J. I., Goldstein, I. M., Snyderman, R. . Inflammation: Basic Principles and Clinical Correlates. 112, 325-336 (1992).
- Morris, L., Graham, C. F., Gordon, S. Macrophages in haemopoietic and other tissues of the developing mouse detected by the monoclonal antibody F4/80. Development. 112, 517-526 (1991).
- Haas, A. The phagosome: compartment with a license to kill. Traffic. 8, 311-330 (2007).
- Underhill, D. M., Ozinsky, A. Phagocytosis of microbes: complexity in action. Annu. Rev. Immunol. 20, 825-852 (2002).
- Castagna, A., Polati, R., Bossi, A. M., Girelli, D. Monocyte/macrophage proteomics: recent findings and biomedical applications. Expert Rev. Proteomics. 9, 201-215 (2012).
- Benoit, M., Desnues, B., Mege, J. L. Macrophage polarization in bacterial infections. J. Immunol. 181, 3733-3739 (2008).
- Barry, A. O., et al. Impaired stimulation of p38alpha-MAPK/Vps41-HOPS by LPS from pathogenic Coxiella burnetii prevents trafficking to microbicidal phagolysosomes. Cell Host Microbe. 12, 751-763 (2012).
- Henry, R. M., Hoppe, A. D., Joshi, N., Swanson, J. A. The uniformity of phagosome maturation in macrophages. J. Cell Biol. 164, 185-194 (2004).
- Sundaramurthy, V., et al. Integration of Chemical and RNAi Multiparametric Profiles Identifies Triggers of Intracellular Mycobacterial Killing. Cell Host Microbe. 13, 129-142 (2013).
- Boltz-Nitulescu, G., et al. Differentiation of rat bone marrow cells into macrophages under the influence of mouse L929 cell supernatant. J. Leukocyte Biol. 41, 83-91 (1987).
