Single-צמח, סטרילי מיקרוקוסמוס לNodulation וצמיחה של צמח הקטניות<em> Medicago truncatula</em> עם סימביונט Rhizobial<em> Sinorhizobium meliloti</em
Summary
צמיחה של צמחי truncatula Medicago בסימביוזה עם meliloti Sinorhizobium חיידקי חנקן כמו במיקרוקוסמוס הבודד, סטרילית עשויים מצלחות מעבדה סטנדרטיות מאפשרת בדיקה תכופה של מערכת שורשים וגושים בלי להתפשר על סטריליות. יכולים להישמר צמחים בתאי גידול אלה לתקופה של עד 9 שבועות.
Abstract
חיידקי Rhizobial יוצרים גושים על השורשים של צמחי קטניות מארח תואמים סימביוטיים, תיקון חנקן. אחת ממערכות המודל הכי המפותחת לחקר אינטראקציות אלה הוא הצמח Medicago truncatula קורות חיים. Jemalong A17 וחיידק Sinorhizobium rhizobial meliloti 1021. הדמיה חוזרת ונשנית של שורשי צמח וניקוד של פנוטיפים סימביוטיים דורשת שיטות שאינן הרסניים לשני צמחים או חיידקים. פנוטיפים הסימביוטי של כמה צמחים ומוטציות של חיידקים לעין לאחר תקופות קצרות יחסית של צמיחה, ואינו דורשים תצפית ארוך טווח של האינטראקציה המארח / סימביונט. עם זאת, הבדלים דקים בפנוטיפים יעילות והזדקנות גולה הסימביוטי שאינם נראות לעין בשלבים המוקדמים של תהליך nodulation השלבים דורשים תקופות צמיחה ארוכות יחסית לפני שהם יכולים להיות קלע. כמה שיטות פותחו לצמיחה לטווח ארוך ותצפית של זוג המארח / סימביונט זה.עם זאת, רבים של שיטות אלה דורשים השקיה חוזרת ונשנית, דבר המגדילה את האפשרות של זיהום על ידי חיידקים אחרים. שיטות אחרות דורשות שטח גדול יחסית לצמיחה של מספר רב של צמחים. השיטה מתוארת כאן, צמיחה הסימביוטי של מ ' truncatula / S. meliloti במיקרוקוסמוס סטריליים, חד צמח, יש לו כמה יתרונות. לצמחים יש במיקרוקוסמוס אלה לחות וחומרים מזינים מספיק כדי להבטיח השקיה שאינה נדרשה לתקופה של עד 9 שבועות, מניעת זיהום צולב במהלך השקיה. זה מאפשר לפנוטיפים לכמת שעלולה לפספס במערכות צמיחה לטווח קצר, כגון עיכובים עדינים בפיתוח גולה גולה והזדקנות מוקדמת. כמו כן, הם צפו השורשים וגושים במיקרוקוסמוס קלות באמצעות מכסה הצלחת, אז עד-השתרשות של הצמחים לצורך ההשגחה אינו נדרש.
Introduction
האינטראקציה בין truncatula הצמח פונדקאי קטניות Medicago A17 וחיידק rhizobial Sinorhizobium meliloti 1021 היא אחת ממערכות המודל הצייתניות ביותר ללימוד פיתוח גולה שורש וסימביוזת קיבוע חנקן. הגנום של שני בני הזוג הסימביוטי היה רצף 1,2 וגם הצמח וחיידק נוחות ל3,4 מניפולציה הגנטי. ניתוח של פנוטיפים של שני צמחים וחיידקי מוטציות דורש היכולת להתבונן שלבי התפתחות גולה ולכמת את הפרודוקטיביות סימביוטיים לאורך זמן. כאן אנו מתארים שיטה להתבוננות בפיתוח גולה שורשו של מ ' truncatula קורות חיים. A17 Jemalong מחוסן עם ס ' meliloti 1021 בתוך מיקרוקוסמוס הבודד עשוי מרגיל, בקוטר 100 מ"מ עגול, צלחות מעבדה עמוקות 15 מ"מ (איור 1 א). לירות חשוף וצומח דרך פורטל מחורצים בצד השני של הצלחת (figures 1B, 1C, ו1E). שורשים נמצאים בתוך מיקרוקוסמוס והמשיכו סטרילי, תוך מתן אפשרות לתצפית באמצעות המכסה של הצלחת (1D איור). מאז הצילומים הוא נגישים, הצמיחה שלה אינה מוגבלת וניתן למדוד אותו בפרקי הזמן מבלי להתפשר על סטריליות של השורש. השיטה של יצירת מיקרוקוסמוס מחורצים הצלחת פותחה במקור על ידי לי, et al. 5 לגידול צמחי אספסת, אבל זה לא אומץ באופן נרחב למרות היתרונות הרבים שלה על פני שיטות אחרות. וריאציה על שיטה זו פותחה גם היא לניתוח של האינטראקציה בין שורשי צמח וmycorrhizae 6. עכשיו יש לנו להתאים ומותאם בשיטה זו לצמיחתו של מ ' צמחי truncatula. היתרונות של פרוטוקול זה על פני יותר נפוץ שיטות מתוארים להלן.
ישנן מספר שיטות שנמצאות כיום בשימוש רחב ללימודי nodulation של מ ' truncatula inoculated עם ס ' meliloti 7. השיטה הנפוצה ביותר להכנה בקנה מידה גדולה של שורשי nodulated היא צמיחה בcaissons aeroponic 7. בשיטה זו, צמחים מושעים על כלי גדול ושורשי מוגזים בתערובת של ס meliloti ופתרון תזונתי 7. שיטה זו היא מעשית אם רק אחד גנוטיפ של ס ' meliloti הוא להיבדק. מכיוון שהוא דורש aerosolization של ריכוזים גבוהים של חיידקים, יש הסתברות גבוהה של זיהום צולב בין caissons מחוסן עם זני חיידקים שונים. שיטה נוספת המשמשת לעתים קרובות כדי להכין כמויות גדולות של צמחים מחוסן היא צמיחה באמבטיות או סירים של פרלייט, vermiculite, חול או חימר calcined שהם חדורים עם פתרון תזונתי ומחוסן עם ס ' meliloti 7. שיטה זו מחייבת שימוש באמבטיות או סירים פתוחים, ודורשת השקיה וחידוש מלאי של הפתרון התזונתי. חסרון נוסף של סירים הוא שצמחיםיש להסיר מן מטריצת חלקיקים זה לבחינה של השורשים וגושים. חסרון נוסף של שיטה זו הוא ששטח גדול של שטח חממה דרוש בעת ש 'רבים ושונה גנוטיפים meliloti הם להיות בהשוואה, בגלל סיר נפרד יש להשתמש עבור כל גנוטיפ חיידקים. "צנצנת לאונרד" היא וריאציה על 8,9 בשיטה זו. צנצנת לאונרד מורכבת משני כלי מעוקרים נערמו אחד על גבי השני ומחוברים על ידי פתיל. מדיום גידול ממוקם בכלי הנמוך ונמשך דרך הפתילה ידי פעולת נימים לתוך מטריצת צמיחה של פרלייט, vermiculite, חול או חימר calcined בכלי העליון. השתיל (ים) ממוקמים במטריצת הצמיחה ומחוסנת עם ס ' meliloti. שיטה זו אינה דורשת השקיה, אבל בחינה של שורשים וגושים דורשת כי השתיל יוסר ממטריצת צמיחת החלקיקים.
ישנן מספר שיטות שמאפשרות בדיקה קלה של רוts. אחד מהם הוא "כיס צמיחת" פלסטיק השקוף 7. חסרון של שיטה זו הוא שהשקיה תכופה נדרשת שכן רק ≤ 10 מיליליטר המדיום נוזלי הוא אופטימלי לגידול מ truncatula בשקיות 7. ניסויי פאוץ גם בדרך כלל מוגבלים ל~ 2 שבועות 7, עקב התמוטטות של פתיל נייר בתוך הכיס. שתי שיטות אחרות המשמשות בדרך דומות לשיטה שלנו שבצמחים גדלים על אגר והשורשים גלויים לעין, אך שיטות אלה יש גם חסרונות, כי ההליך שלנו נמנע. בשיטות אלה, צמחים כלולים לחלוטין בתוך 24.5 סנטימטר x 24.5 צלחות אגר סנטימטר אטום סביב החלק העליון עם קלטת כירורגית נקבובית או גדלו בצינורות אגר שיפוע פקוק עם תקעי כותנה או כובעי פלסטיק 7. שתי שיטות אלה מאפשרים בדיקה קלה של שורשים ויכולים להישמר סטרילי. עם זאת, צינורות השיפוע אגר בדרך כלל גדלו עם רק 20 מיליליטר אגר בינוני 7 ודורשים השקיה ומזיןddition לצמיחה לטווח ארוך של צמחים. צמחים הגדלים בתוך 24.5 סנטימטר x יש לי 24.5 מיקרוקוסמוס הצלחת אגר סנטימטר לחות וחומרים מזינים לצמיחה לטווח ארוך מספיק, אבל לירות במהירות הגוברת הופך מוגבל בתוך המיקרוקוסמוס הצלחת הסגור וגז אתילן יכולים להצטבר עיכוב nodulation 7. בהליך שתואר כאן, לירות חשוף וגדל באופן חופשי מחוץ למיקרוקוסמוס המכיל ~ 70 מיליליטר של תקשורת, המאפשר צמיחה לטווח ארוך.
ההליך המתואר כאן עשוי להיות שימושי לא רק ללימוד nodulation של צמחי קטניות, אלא גם לחקר פנוטיפים שורש של צמחים בגודל בינוני אחרים. ההבדל בין מיקרוקוסמוס אלה וצנצנת רקמות תרבות צמח פוליקרבונט מסורתית הוא כי שורשים במיקרוקוסמוס הצלחת מתוארים כאן גדלים על המשטח האנכי של אגר ולא למטה לתוך שכבה אופקית של אגר בתחתית הצנצנת. זה מאפשר לשורש שהמריא מהמשטח אגר עם ד המינימליamage לשערות שורש והידבקות מינימאלית של אגר אל פני השטח השורש, המאפשר הבחינה של שערות שורש על ידי מיקרוסקופ.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מספר צעדים לפרוטוקול כי הם קריטיים להצלחה: 1) שיש הצורך בשימוש בתרבית תאים מטוהר, צמח נבדק אגר לא יכול להדגיש יתר על מידה. זה לא קריטי עבור שתילי אספסת, אבל את זה הוא קריטי לצמיחתו של מ ' truncatula A17. 2) חשוב לנבוט שתילים על צלחות אגר אנכיות כפי שמתואר בשלב 1. הטכניק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו מומנה על ידי המכון הלאומי למשרד חקלאות מזון והחקלאות, חקלאות ומזון מענק מחקר יוזמה 2010-65,108 – 20582 לKMJ אנו מודים לבריאן ק וושבורן לבדיקה ביקורתית של כתב היד.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Agar purified, plant cell culture-tested | Sigma | A7921 |
References
- Galibert, F., et al. The composite genome of the legume symbiont Sinorhizobium meliloti. Science. 293, 668-672 (2001).
- Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insight into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480, 520-524 (2011).
- Glazebrook, J., Walker, G. C. Genetic techniques in Rhizobium meliloti. Methods Enzymol. 204, 398-418 (1991).
- Cheng, X., Wen, J., Tadege, M., Ratet, P., Mysore, K. S. Reverse genetics in medicago truncatula using Tnt1 insertion mutants. Methods Mol Biol. 678, 179-190 (2011).
- Leigh, J. A., Signer, E. R., Walker, G. C. Exopolysaccharide-deficient mutants of Rhizobium meliloti that form ineffective nodules. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 6231-6235 (1985).
- Wong, K. K. Y., Fortin, J. A. A Petri Dish Technique for the Aseptic Synthesis of Ectomycorrhizae. Canadian Journal of Botany-Revue Canadienne De Botanique. 67, 1713-1716 (1989).
- Barker, D. G., Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W., et al. . The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Leonard, L. T. A Simple Assembly for Use in the Testing of Cultures of Rhizobia. J Bacteriol. 45, 523-527 (1943).
- Trung, B. C., Yoshida, S. Improvement of Leonard jar assembly for screening of effective rhizobium. Soil Sci Plant Nutr. 29, 97-100 (1983).
- Penmetsa, R. V., Cook, D. R. Production and characterization of diverse developmental mutants of Medicago truncatula. Plant Physiol. 123, 1387-1398 (2000).
- Garcia, J., Barker, D. G., Journet, E. P., Mathesius, U., Journet, E. P., Sumner, L. W. . The Medicago truncatula handbook. , (2006).
- Vincent, J. M. . A Manual for the Practical Study of the Root-Nodule Bacteria. , (1970).
- Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. . Molecular cloning: a laboratory manual. , (1982).
- Pladys, D., Vance, C. P. Proteolysis during Development and Senescence of Effective and Plant Gene-Controlled Ineffective Alfalfa Nodules. Plant Physiology. 103, 379-384 (1993).
- Vasse, J., de Billy, F., Truchet, G. Abortion of infection during the Rhizobium meliloti-alfalfa symbiotic interaction is accompanied by a hypersensitive reaction. The Plant J. 4, 555-566 (1993).
- Johnson, L. E. B., Vance, C. P. Histological and Biochemical Comparisons of Plant Induced Ineffective Nodules. Phytopathology. 71, 884 (1981).
- Vance, C. P., Johnson, L. E. B., Hardarson, G. Histological Comparisons of Plant and Rhizobium Induced Ineffective Nodules in Alfalfa. Physiological Plant Pathology. 17, 167 (1980).
- Van de Velde, W., et al. Aging in legume symbiosis. A molecular view on nodule senescence in Medicago truncatula. Plant Physiol. 141, 711-720 (2006).
- Jones, K. M. Increased production of the exopolysaccharide succinoglycan enhances Sinorhizobium meliloti 1021 symbiosis with the host plant Medicago truncatula. J Bacteriol. 194, 4322-4331 (2012).
- Queiroux, C., et al. A comparative genomics screen identifies a Sinorhizobium meliloti 1021 sodM-like gene strongly expressed within host plant nodules. BMC Microbiol. 12, 74 (2012).
