Single-plant, Steriel Microcosmi voor nodulatie en groei van de peulvrucht installatie<em> Medicago truncatula</em> Met de stikstofbindende Symbiont<em> Sinorhizobium meliloti</em

De interactie tussen de peulvruchten waardplant Medicago truncatula A17 en de stikstofbindende bacterie Sinorhizobium meliloti 1021 is een van de meest handelbare modelsystemen voor de studie van de wortel nodule ontwikkeling en stikstofbindende symbiose. De genomen van beide symbiotische partners zijn gesequenced ^1,2 en zowel plant als bacterie vatbaar zijn voor genetische manipulatie ^3,4. Analyse van de fenotypen van zowel plantaardige en bacteriële mutanten vereist het vermogen om de stadia van ontwikkeling nodule observeren en de symbiotische productiviteit kwantificeren tijd. Hier beschrijven we een methode voor de waarneming van de wortel knobbel ontwikkeling van M. truncatula cv. Jemalong A17 geënt met S. meliloti 1021 binnen afzonderlijke microkosmos gemaakt van standaard, rond 100 mm diameter, 15 mm diep laboratorium platen (Figuur 1A). De shoot is blootgesteld en groeit door een getande portaal in de zijkant van de plaat (Figures 1B, 1C en 1E). Wortels zijn vervat in de microkosmossen en hield steriele, terwijl waarneming door het deksel van de plaat (figuur 1D). Aangezien de shoot toegankelijk is, is de groei niet beperkt en kan worden gemeten periodiek zonder de steriliteit van de wortel. De methode om getande plaat batches werd oorspronkelijk ontwikkeld door Leigh, et ​​al.. ⁵ voor het kweken alfalfa planten, maar het was niet wijd goedgekeurd ondanks zijn vele voordelen boven andere methoden. Een variant op deze methode werd ontwikkeld voor de analyse van de interactie tussen plantenwortels en mycorrhizae ^6. We hebben nu aangepast en geoptimaliseerd deze methode voor de groei van M. truncatula planten. De voordelen van dit protocol dan meer gebruikelijke methoden worden hieronder beschreven.

Er zijn verschillende methoden die momenteel veel gebruikt voor nodulatie studies van M. truncatula inoculatieberekend met S. meliloti ^7. De meest gebruikte methode voor grootschalige bereiding van bladnodulerende wortels is de groei in luchtteelt caissons ^7. In deze methode worden planten opgehangen over een groot vat en wortels worden belucht met een mengsel van S. meliloti en voedingsoplossing ^7. Deze methode is handig als slechts een genotype van S. meliloti worden uitgetest. Aangezien aërosolvorming van hoge concentraties bacteriën vereist, is er een grote kans op kruisbesmetting tussen caissons geïnoculeerd met verschillende bacteriestammen. Een andere methode die vaak wordt gebruikt om grote hoeveelheden geïnoculeerde planten bereiden is groei in kuipen of potten van perliet, vermiculiet, zand of gecalcineerde klei die zijn doordrenkt met voedingsoplossing en geïnoculeerd met S. meliloti ^7. Deze methode vereist het gebruik van open bakken of potten, en vereist drenken en het bijvullen van de voedingsoplossing. Een ander nadeel van potten is dat plantenmoeten worden verwijderd uit deze deeltjes matrix voor het onderzoek van de wortels en knobbeltjes. Een ander nadeel van deze werkwijze is dat een groot gebied van incubator ruimte nodig wanneer veel verschillende S. meliloti genotypen worden vergeleken, omdat een aparte pot worden gebruikt voor elke bacteriële genotype. De "Leonard jar" is een variant op deze methode ^8,9. Een Leonard pot bestaat uit twee gesteriliseerd vaartuigen gestapeld bovenop elkaar en verbonden door een lont. Groeimedium geplaatst in het onderste vat opgesteld door de lont door capillaire werking in een groeimatrix perliet, vermiculiet, zand of gecalcineerde klei in het bovenste vat. De zaailing (s) in de groei matrix geplaatst en geïnoculeerd met S. meliloti. Deze methode vereist geen water geven, maar onderzoek van wortels en knobbeltjes vereist dat de zaailing van de deeltjes groei matrix worden verwijderd.

Er zijn verschillende methoden die wel toestaan ​​eenvoudig onderzoek van roots. Een daarvan is de doorzichtige plastic "growth etui" ^7. Een nadeel van deze werkwijze is dat vaak water nodig aangezien slechts ≤ 10 ml vloeibaar medium voor optimale groei M. truncatula in zakjes ^7. Pouch experimenten worden ook meestal beperkt tot ~ 2 weken ^7, als gevolg van afbraak van het papier lont in het zakje. Twee andere methoden die algemeen worden gebruikt zijn vergelijkbaar met onze werkwijze dat de planten gekweekt op agar en wortels zichtbaar, maar deze werkwijzen hebben ook nadelen dat onze procedure vermijdt. In deze werkwijzen worden planten geheel opgenomen binnen 24.5 cm x 24.5 cm agarplaten afgedicht rond de bovenkant met poreuze chirurgische tape of gekweekt in-agar schuine buizen afgesloten met prop watten of plastic doppen ^7. Beide methoden maken een eenvoudige onderzoek van wortels en kunnen steriel worden gehouden. Echter, de agarslant buizen meestal gekweekt met slechts 20 ml agar medium ⁷ en vereisen drenken en voedingsstoffen eenddition voor lange termijn groei van planten. Planten binnen de 24,5 cm x 24,5 cm agar plaat microkosmossen voldoende vocht en voedingsstoffen voor de groei op lange termijn, maar de groeiende shoot snel wordt beperkt binnen de bijgevoegde plaat microkosmos en ethyleen gas kan opbouwen remmen nodulatie ^7. In de hier beschreven procedure, wordt de shoot blootgesteld en groeit vrij buiten de microkosmos die ~ bevat 70 ml van de media, waardoor de groei op lange termijn.

De hier beschreven procedure kan niet alleen nuttig zijn voor de studie van nodulatie van vlinderbloemige planten, maar ook voor de studie van wortel fenotypen andere middelgrote planten. Het verschil tussen deze microkosmossen en een traditionele polycarbonaat plantenweefsel cultuur pot is dat wortels in de plaat batches beschreven groeien op het verticale oppervlak van de agar dan naar beneden in een horizontale laag van agar onderaan de pot. Hierdoor kan de wortel worden getild van het agar oppervlak met minimale dAmage naar wortelharen en minimale hechting van agar aan de wortel oppervlak, dat het onderzoek van wortelharen vergemakkelijkt door microscopie.