Summary

Elektron Probe X-ışını Mikroanaliz tarafından Nöronlar Toplam Kalsiyum Ölçümü

Published: November 20, 2013
doi:

Summary

Bu kağıt fizyolojik tanımlanan biyolojik numunelerde subselüler çözünürlükte toplam kalsiyum içeriği ve dağılımı kantitatif ölçümüne cryoanalytical elektron mikroskobu uygulamasını açıklar.

Abstract

Bu yazıda Electron Probe Micro (EPMA) olarak bilinen teknik kullanılarak araçlar, teknikler ve hücre içi element içeriği nicel ölçümü için uygun bir alet açıklanmaktadır. Intramitokondriyal kalsiyum nedeniyle mitokondriyal kalsiyum aşırı nörodejeneratif hastalıklarda oynadığı kritik rolü belli bir odak noktasıdır. Yöntem, X-ışınları analizi örnek ile bir elektron ışını etkileşimi ile bir elektron mikroskobu (EM) oluşturulur dayanmaktadır. Elektron mikroskobu örneklerinde yayılabilir elemanlarının yerel bir dağılımının muhafaza edilmesi için, ultra ince EPMA cryosections hazırlanması ve ardından doku "cryofixation" gerektirir. Kültürlenmiş hücreler ya da Organotipik dilim kültürlerinin hızlı dondurma sırasıyla soğuk metal bloğun karşı sıvı etan veya çarpma dondurma ile dondurma dalma ile gerçekleştirilir. Kriyokesitler nominal kalınlığında 80 nm ca bir elmas bıçakla kuru kesilir. -16076, C, karbon / pioloform kaplı bakır ızgaralar üzerine monte edilmiş ve özel bir cryospecimen tutucu kullanarak cryo-EM içine cryotransferred. C ve düşük elektron doz ≤ ° -160 görsel ve diğer yer haritalama sonra, dondurulmuş hidratlanmış cryosections dondurularak kurutuldu, ~ 30 dakika boyunca 100 ° C altındadır. Kuru cryosections of organel düzey görsel yavaş tarama CCD kamera ve analiz için seçilen ilgi hücre içi bölgeleri ile, aynı zamanda, düşük bir dozda, kaydedilir. Bir sabit, odaklanmış, yüksek yoğunluklu elektron probu ile ROI yayılan X-ışınları, bir enerji dağıtıcı X-ray (EDX) ilişkili elektroniği tarafından işlenir spektrometresi, ve bir X-ışını spektrumu olarak sunulan toplanır, yani, bir enerji vs X-ışını yoğunluğu arsa. Ek yazılım kolaylaştırır: onların "karakteristik" pik enerjileri ve parmak izi ile elemental bileşenlerin 1) kimlik ve pik alanları / arka plan çıkarma 2) kantitatif analizi. Bu kağıt tipik gösteren iki örnek ile sona eriyorMitokondriyal kalsiyum analizi iskemi direncinin temelini ortaya eksitotoksik yaralanmalara ve diğerinin mekanizmaları önemli bir fikir temin edilen bir hangi EPMA uygulamaları.

Introduction

Kalsiyum iyonları sinaptik iletimi ve gen ifadesi olarak çeşitli normal süreçlerde önemli bir rol oynuyor, belki biyolojideki en önemli ve çok yönlü hücre sinyal varlık vardır. Öte yandan, kalsiyum hücre ölümünde de eşit derecede önemlidir. Özellikle, kalsiyum serbestleşme inme nöronal yaralanmaya önemli bir faktördür, Parkinson hastalığı, Alzheimer ve diğer nörodejeneratif hastalıklar 3,5. Böylece, kalsiyum hücre içinde nasıl dağıtıldığı kantitatif anlamak için son derece önemlidir ve nasıl bu fizyolojik veya patofizyolojik uyaranlara aşağıdaki değiştirir. Çözelti içinde serbest veya bir substrata bağlanmış – – ve hücresel kalsiyum konsantrasyonları stimülasyon bir sonucu olarak, birkaç büyüklük içinde değişebilir, bu amaç, kalsiyum dinamik olarak iki fiziksel durumlar arasında dağıtılır gerçeği ile karmaşıktır.

Fr analizi için çeşitli yöntemler gelişmiş olsa da,hücre içi kalsiyum ee, tanımlanmış hücre içi bölümlerinde toplam kalsiyum konsantrasyonları belirlenmesi gerçekçi bir yaklaşımda, yani elektron probu mikroanaliz (EPMA) ile sınırlıdır. EPMA bu çiftler, bir transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ile bir X-ışını spektrometresi bir tekniktir. TEM elektron tabancası ilgi ve elektron bombardımanı sonucunda yayılan eleman özgü X-ışınları bir alt hücresel bölgede sabit, Mikronaltı elektron prob odaklanır (ayrıntılı teknik değerlendirmeleri için başvurular 7, 4'e bakın) toplanır ve analiz edilir. EPMA Avantajları tek organel düzeyinde çözünürlüğe ve submillimolar hassasiyet vardır. Ancak uygulamada, EPMA numune hazırlanması ve analizi için özel cryotechniques ve aletleri gerektirir. Burada, araçlar, teknikler ve EPMA kullanılarak hücre içi kalsiyum ölçümleri için uygun araçlar açıklanmıştır. Intramitokondriyal kalsiyum özel i olankritik rol nedeniyle nterest bu nörodejeneratif hastalıklarda mitokondriyal kalsiyum aşırı çalış.

Protocol

Burada açıklanan yaklaşım özel araçlar, araçlar ve yazılımlar kullanarak geliştirilmiştir. Laboratuvarları, aynı deney düzeneği kullanarak olmayacak çünkü yaklaşım mümkün jeneralize. 1.. Hızlı Dondurma Bu dondurma anda canlı hücrelerde olduğu gibi nicel yayılabilir doku bileşenleri ve kimyasal elementlerin dağılımını koruyan bir şekilde hücreler ya da dokuların 1) "cryofixation": tarif edilecek olan analitik yöntem i?…

Representative Results

Beyin hücreleri tipik olarak işemik koşulları altında ortaya çıkar ve patolojik sinir-iletici salıverilmesinde bir sonucu olarak eksitotoksik incinme. EPMA kalsiyum büyük miktarda ayırmak için nöronal mitokondri yeteneği yaralanma mekanizmasının temelini nasıl keşfetmek için kritik oldu. Şekil 3'teki elektron mikrografı hızlı bir eksitotoksik uyarıcı (100 uM NMDA) ile 30 dakika maruz kaldıktan sonra dondurulabilir kültürlenmiş hipokampal nöronlar dondurularak kurutulmu?…

Discussion

Elektron mikroskobu tabanlı bir analitik yöntem, burada sunulan saptama, tanımlama ve Na, K, P, Ca ve özellikle de dahil olmak üzere biyolojik ilgi çeşitli elemanları, miktar tayini için olanak sağlar. Bu analizler, hücre içi de gerçekleştirilebilir, yani, intra-organel, hızlı bir şekilde dondurulmuş numuneler hazırlanmış kriyo seksiyonlarda yüksek kaliteli görüntüler ilgi yapıları bulmak ve tespit etmek yeteneği sayesinde çözünürlük. Boyanma dokusu elemanlarının yer nicel ola…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz mükemmel teknik yardım için Bayan Christine A. Winters teşekkür etmek istiyorum. Bu çalışma NINDS İntramural Araştırma Programı, NIH (Z01 NS002610) Temel Nörobilim Programı tarafından desteklenmiştir.

Materials

REAGENTS/MATERIALS
Thermanox plastic coverslips Thermo Fischer Scientific 72280
Culture inserts BD Falcon 353090 For 6-well plates
Cryopins Leica Microsystems 16701952 Grooved
Wood applicators EM Sciences 72300
Folding EM grids Ted Pella 4GC100/100 100 mesh
Indium foil Alfa Aesar 13982 0.25 mm thick
EQUIPMENT
Plunge freezing device Leica Microsystems KF-80
Slam freezing device LifeCell CF-100
Ultramicrotome Leica Microsystems UC6
Cryoattachment for microtome Leica Microsystems FC6
Diamond cryotrimming tool Diatome Cryotrim 45
Diamond cryoknife Diatome Cryo 35
Antistatic device Diatome Hauf Static Line
Cryo electron microscope Carl Zeiss Microscopy EM912 Omega
EM cryo specimen holder Gatan CT3500
Slow-scan CCD camera, 2k x 2k Troendle (TRS) Sharpeye
Image acquisition software Olympus SIS iTEM suite
ED x-ray detector Oxford Instruments Linksystem Pentafet
Pulse Processor Oxford Instruments XP-3
PCI backplane card 4pi Systems Spectral Engine II
Desktop computer Apple Any OS9-compatible model
X-ray analysis software NIST DTSA, DTSA II
Spreadsheet software Microsoft Excel
  1. The CF100 is no longer sold commercially, although the machine is available at many academic facilities, and complete machines or parts can be found on-line.
  2. A video tutorial for the CT3500 cryotransfer holder is available at http://www.gatan.com/files/Movies/CT3500_Cryo_transfer_holder.mp4.
  3. The SEII is obsolete; the Universal Spectral Engine Is a later, PC-compatible product with comparable functionality. 4pi has ceased manufacturing and sales but still provides technical customer support. Used systems are often found online.
  4. The original DTSA is now obsolete. NIST offers in the public domain an updated successor, DTSA II 12 (http://www.nist.gov/mml/mmsd/software.cfm)

References

  1. Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens. Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).
  2. Aronova, M. A., Leapman, R. D. Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology. Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).
  3. Bezprozvanny, I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases. Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).
  4. Fernandez-Segura, E., Warley, A. Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology. Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).
  5. Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).
  6. Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
  7. LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology. Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).
  8. Newbury, D. E. The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector. Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).
  9. Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections. J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).
  10. Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics. J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).
  11. Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).
  12. Ritchie, N. W. Spectrum simulation in DTSA-II. Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).
  13. Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons. Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).
  14. Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr. J. Microsc. 216, 76-83 (2004).

Play Video

Cite This Article
Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. Measurement of Total Calcium in Neurons by Electron Probe X-ray Microanalysis. J. Vis. Exp. (81), e50807, doi:10.3791/50807 (2013).

View Video