Medición de calcio total en neuronas por Sonda de Electrones X-ray microanálisis
Summary
En este trabajo se describe la aplicación de la microscopía electrónica cryoanalytical para la medición cuantitativa de contenido de calcio total y su distribución en la resolución subcelular en muestras biológicas fisiológicamente definidos.
Abstract
En este artículo se describen las herramientas, las técnicas y los instrumentos adecuados para las mediciones cuantitativas de contenido elemental intracelular mediante la técnica conocida como microanálisis de sonda de electrones (EPMA). Calcio intramitocondrial es un enfoque particular debido al papel crítico que la sobrecarga de calcio mitocondrial desempeña en las enfermedades neurodegenerativas. El método se basa en el análisis de los rayos X generados en un microscopio electrónico (EM) por la interacción de un haz de electrones con la muestra. Con el fin de mantener la distribución natural de los elementos difusibles en especímenes de microscopía de electrones, EPMA requiere "criofijación" de tejido seguido de la preparación de secciones criogénicas ultrafinas. La congelación rápida de las células cultivadas o cultivos de cortes organotípicos se lleva a cabo por inmersión de congelación en etano líquido o por la congelación de golpe contra un bloque de metal en frío, respectivamente. Criosecciones nominalmente 80 nm de espesor se cortan en seco con un cuchillo de diamante en ca. -16076; C, montada en / rejillas de cobre Pioloform recubierto de carbono y cryotransferred en una crio-EM utilizando un soporte cryospecimen especializada. Después de la inspección visual y la cartografía de la ubicación a ≤ -160 ° C y la dosis de electrones de baja, cryosections congelados hidratado son liofilizada a -100 º C durante aproximadamente 30 min. Imágenes de nivel de Orgánulos de criosecciones secos se registran, también a baja dosis, por medio de una cámara CCD de barrido lento y regiones subcelulares de interés seleccionado para el análisis. Los rayos X emitidos desde ROI por un centrado, sonda de electrones estacionaria, de alta intensidad son recogidos por una placa de rayos X de dispersión de energía (EDX) espectrómetro, procesada por la electrónica asociada, y presentada como un espectro de rayos X, es decir, una gráfico de la intensidad de rayos X de energía vs. Software adicional facilita: 1) la identificación de los componentes elementales de sus "características" energías pico y huellas dactilares, y 2) el análisis cuantitativo mediante la extracción de las áreas de pico / fondo. Este documento concluye con dos ejemplos que ilustran típicaAplicaciones EPMA, una en la que el análisis de calcio mitocondrial proporcionado una visión crítica de los mecanismos de lesión excitotóxica y otro que revelaron la base de la resistencia a la isquemia.
Introduction
Los iones de calcio son, posiblemente, la entidad de señalización celular más importante y versátil en biología, que juega un papel esencial en los procesos normales tan diversos como la transmisión sináptica y la expresión génica. Por otro lado, el calcio es igualmente importante en la muerte celular. En particular, la desregulación del calcio es un factor clave en el daño neuronal en el ictus, Parkinson, Alzheimer y otras enfermedades neurodegenerativas 3,5. Por lo tanto, es críticamente importante entender cuantitativamente cómo se distribuye de calcio dentro de las células, y cómo esto cambia después de estímulos fisiológicos o fisiopatológicos. Este objetivo se complica por el hecho de que el calcio se distribuye dinámicamente entre los dos estados físicos – libre en solución o unido a un sustrato – y que las concentraciones de calcio celular cambian a lo largo de varios órdenes de magnitud, como consecuencia de la estimulación.
Si bien existen varias metodologías avanzadas disponibles para el análisis de free de calcio intracelular, la determinación de las concentraciones de calcio total en compartimentos intracelulares definidos se limita de manera realista a un enfoque, a saber, microanálisis de sonda de electrones (EPMA). EPMA es una técnica que las parejas un espectrómetro de rayos X para un microscopio electrónico de transmisión (TEM). El cañón de electrones TEM se centra una sonda electrónica submicras estacionaria en una región subcelular de interés y los rayos X de elementos específicos emitidos como resultado del bombardeo de electrones son recogidos y analizados (ver referencias 7, 4 para revisiones técnicas detalladas). Ventajas de EPMA incluyen sola resolución a nivel de orgánulo y sensibilidad submilimolar. En la práctica, sin embargo, requiere EPMA cryotechniques e instrumentos especializados para la preparación y análisis de muestras. Aquí se describen las herramientas, técnicas e instrumentos adecuados para la medición de calcio intracelular usando EPMA. Calcio intramitocondrial es de i especiall interés en cuenta el papel fundamental que desempeña la sobrecarga de calcio mitocondrial en las enfermedades neurodegenerativas.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método analítico basado en microscopio electrónico de que aquí se presenta permite la detección, identificación, y cuantificación de varios elementos de interés biológico, incluidos Na, K, P, Ca y especialmente. Estos análisis pueden llevarse a cabo en subcelular, es decir, dentro de la orgánulo, la resolución debido a la capacidad de localizar e identificar estructuras de interés en imágenes de alta calidad de criosecciones preparados a partir de muestras congeladas rápidamente. Tenga en cuen…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nos gustaría dar las gracias a la Sra. Christine A. Winters por su excelente asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Programa de Neurociencia Básica del Programa de Investigación Intramural NINDS, NIH (Z01 NS002610).
Materials
| REAGENTS/MATERIALS | |||
| Thermanox plastic coverslips | Thermo Fischer Scientific | 72280 | |
| Culture inserts | BD Falcon | 353090 | For 6-well plates |
| Cryopins | Leica Microsystems | 16701952 | Grooved |
| Wood applicators | EM Sciences | 72300 | |
| Folding EM grids | Ted Pella | 4GC100/100 | 100 mesh |
| Indium foil | Alfa Aesar | 13982 | 0.25 mm thick |
| EQUIPMENT | |||
| Plunge freezing device | Leica Microsystems | KF-80 | |
| Slam freezing device | LifeCell | CF-100 | |
| Ultramicrotome | Leica Microsystems | UC6 | |
| Cryoattachment for microtome | Leica Microsystems | FC6 | |
| Diamond cryotrimming tool | Diatome | Cryotrim 45 | |
| Diamond cryoknife | Diatome | Cryo 35 | |
| Antistatic device | Diatome | Hauf Static Line | |
| Cryo electron microscope | Carl Zeiss Microscopy | EM912 Omega | |
| EM cryo specimen holder | Gatan | CT3500 | |
| Slow-scan CCD camera, 2k x 2k | Troendle (TRS) | Sharpeye | |
| Image acquisition software | Olympus SIS | iTEM suite | |
| ED x-ray detector | Oxford Instruments | Linksystem Pentafet | |
| Pulse Processor | Oxford Instruments | XP-3 | |
| PCI backplane card | 4pi Systems | Spectral Engine II | |
| Desktop computer | Apple | Any OS9-compatible model | |
| X-ray analysis software | NIST | DTSA, DTSA II | |
| Spreadsheet software | Microsoft | Excel | |
|
References
- Aronova, M. A., Kim, Y. C., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B., Leapman, R. D. Quantitative EFTEM mapping of near physiological calcium concentrations in biological specimens. Ultramicroscopy. 109, 201-212 (2009).
- Aronova, M. A., Leapman, R. D. Elemental mapping by electron energy loss spectroscopy in biology. Methods Mol. Biol. 950, 209-226 (2013).
- Bezprozvanny, I. Calcium signaling and neurodegenerative diseases. Trends Mol. Med. 15, 89-100 (2009).
- Fernandez-Segura, E., Warley, A. Electron probe X-ray microanalysis for the study of cell physiology. Methods Cell Biol. 88, 19-43 (2008).
- Gibson, G. E., Starkov, A., Blass, J. P., Ratan, R. R., Beal, M. F. Cause and consequence: Mitochondrial dysfunction initiates and propagates neuronal dysfunction, neuronal death and behavioral abnormalities in age-associated neurodegenerative diseases. Biochim. Biophys. Acta. 1802, 122-134 (2010).
- Leapman, R. D. Novel techniques in electron microscopy. Curr. Opin. Neurobiol. 14, 591-598 (2004).
- LeFurgey, A., Bond, M., Ingram, P. Frontiers in electron probe microanalysis: application to cell physiology. Ultramicroscopy. 24, 185-219 (1988).
- Newbury, D. E. The new X-ray mapping: X-ray spectrum imaging above 100 kHz output count rate with the silicon drift detector. Microsc. Microanal. 12, 26-35 (2006).
- Pierson, J., Vos, M., McIntosh, J. R., Peters, P. J. Perspectives on electron cryotomography of vitreous cryo-sections. J. Electron Microsc. 60, S93-S100 (2011).
- Pivovarova, N. B., Hongpaisan, J., Andrews, S. B., Friel, D. D. Depolarization-induced mitochondrial Ca accumulation in sympathetic neurons: spatial and temporal characteristics. J. Neurosci. 19, 6372-6384 (1999).
- Pivovarova, N. B., Nguyen, H. V., Winters, C. A., Brantner, C. A., Smith, C. L., Andrews, S. B. Excitotoxic calcium overload in a subpopulation of mitochondria triggers delayed death in hippocampal neurons. J. Neurosci. 24, 5611-5622 (2004).
- Ritchie, N. W. Spectrum simulation in DTSA-II. Microsc. Microanal. 15, 454-468 (2009).
- Stanika, R. I., Winters, C. A., Pivovarova, N. B., Andrews, S. B. Differential NMDA receptor-dependent calcium loading and mitochondrial dysfunction in CA1 vs. CA3 hippocampal neurons. Neurobiol. Dis. 37, 403-411 (2010).
- Zhang, P., et al. Direct visualization of receptor arrays in frozen-hydrated sections and plunge-frozen specimens of E. coli engineered to overproduce the hemotaxis receptor Tsr. J. Microsc. 216, 76-83 (2004).
