全タンパク質の抽出および2次元ゲル電気泳動法のための<em>バークホルデリア</em>種

バークホルデリア属以上 62種、ニッチの広い範囲から単離されたグラム陰性菌を含み、それは、2つの主要なクラスター^1,2に分割される。最初のクラスタは、ヒト、動物およびphytotrophic生物を含み、ほとんどの研究は、それらの臨床的重要性は、この群の病原性種に焦点を当てている。最も病原性のメンバーはBである。疽菌とB （それぞれ類鼻疽及び鼻疽を引き起こす） 鼻疽菌 ^3,4および嚢胞性線維症（CF）および慢性肉芽腫症（CGD）の病気を引き起こす日和見病原体^5（バークホルデリア·セパシア複合体、BCCの17定義された種^）、1。 30以上の非病原性の種と第二のクラスタは、植物が、環境に関連する細菌が含まれており、ホスト²に対して潜在的に有益であると考えている。

数多くの合併症はFRをemergeこのような理由例^6-9のほとんどで根絶するのは難しいことの抗生物質に固有または獲得抵抗性の患者、病気の蔓延や治療の失敗の間に病原体の伝達などのバークホルデリア属の病原性メンバーとOM細菌感染。そのため、細菌感染の確立のための基礎をより明確に理解を得ることは、これらの生物によって引き起こされる疾患の治療に不可欠である。感染の確立への洞察を得るために、病因に関連する細菌成分について鋭意検討が必要とされている。プロテオミクスアプローチを用いてバークホルデリア生物のプロテオーム解析に焦点を当てた研究は、細菌病因に関与ならびにそれらのプロテオームの変化は^{10-16プロファイル}されているタンパク質を記載している。

高濃を含む溶解緩衝液中で超音波処理および凍結融解サイクルを用いてタンパク質抽出法尿素のentration、洗剤および両性電解質と組み合わせた尿素は、 バークホルデリアプロテオミクス研究^10-13に適用されている。尿素は、タンパク質変性のための非常に効率的であるが、それによって（カルバミル化反応）アーティファクト¹⁷を形成し、アミノ酸基と反応することができるイソシアン酸アンモニウムを用いて水溶液中で平衡を確立することができる。したがって、シアン酸捕捉剤として機能するキャリア両性電解質を含み、かつ37℃で¹⁷以上の温度を避けることをお勧めします。さらに、タンパク質の定量化と溶解緩衝液の任意の化学的干渉を防止するために、同一の溶解緩衝液は、試料および標準は、同じ背景^10を有するように、標準曲線を作成するために使用することができる。他の方法は、熱の潜伏期間^17,18とアルカリ性の緩衝液や洗剤の使用を含む、しかし、これらの条件は、プロテオームの変化を誘発する可能性があり、いくつかの界面活性剤は、PRと互換性がありませんoteomicsアプリケーションは、その後の界面活性剤除去工程は^、17,18が含まれている場合を除きます。

適切な抽出および定量化の後、各々のタンパク質の全体的なタンパク質発現は、二次元（2-D）ゲル電気泳動のようなプロテオミクスアプローチを用いて研究することができる。この技術は、第一、第二次元におけるアクリルアミドゲル電気泳動によってそれらの分子量に応じてその後O'Farell ¹⁹で説明した第一の次元で等電点電気泳動による等電点に係るタンパク質の分離にある、とした。 、その分解能と感度に、この技術は、複雑な生物学的供給源^19,20からのタンパク質の分析と検出するための強力なツールです。この分離技術は、転写後の修正またはタンパク質分解処理によって引き起こされるタンパク質のアイソフォームを解決する大きな利点をもつタンパク質中心のアプローチでは、現在提供されています。量的変化ゲル²⁰の染色後、対応するスポットの強度を比較することによって検出することができる。しかし、この技術は、非常に大きいタンパク質、膜タンパク質、極端に塩基性および酸性または疎水性タンパク質の同定に適していない、やや面倒で時間のかかる技法²⁰である。より堅牢かつ客観利用可能になると、このようなタグ付け同位体コード親和性^（ICAT）21によるシステイン標識、及びアミノ基のような差動安定同位体標識法によって定量的比較のために使用することが可能である新規ペプチド中心のアプローチ（非ゲルベース）相対と絶対定量（の^iTRAQ）22用のタグ付け同位体で標識する。シングルプロテオミクス技術の使用は、十分な情報を与えるかもしれない、したがって二つの相補的なプロテオミクスアプローチの使用は、プロテオームの中で最も完全な評価の変更が必要である。それにもかかわらず、2-Dゲル電気泳動は、広く使用され、日常的に定量するために適用することができる異なる生物においていくつかのタンパク質の発現をtitative。

ここでは、全細胞タンパク質の抽出およびGEヘルスケア2次元電気泳動原則と方法ハンドブック80から6429-60AC 2004から適応し、最適化したバークホルデリア属のための2次元ゲル電気泳動の手順を説明します（ www.amershambiosciences.com ）。タンパク質抽出を、5mMのEDTA（エチレンジアミン四酢酸）及び1mMのPMSF（フッ化フェニルメチル）を含有するPBSの存在下でガラスビーズをビーズビーターを用いて行った。この手順では、最小限の劣化によるタンパク質の定量化を可能にし、これまでに報告^15,23,24などのプロテオミクスアプローチの修正可能です。 2-Dゲル電気泳動を24 cmの長さに固定化pHを4-7勾配およびタンパク質を用いて行ったが、その等電点に従って分離した。その後、タンパク質は、それらのmolecに従って分離されたSDS-ポリアクリルアミドゲルによってウラル重さ。さらに、我々は、タンパク質スポットを視覚化するための銀染色法、および質量分析のために互換性のある銀染色法を記載した。一緒に、これらの手順は、病因に関与し得るバークホルデリア種からの重要なタンパク質の同定を可能にすることができる。