Extraction des protéines totales et 2-D Méthodes électrophorèse sur gel pour<em> Burkholderia</em> Espèces

Le genre Burkholderia comprend plus de 62 espèces, organismes Gram négatifs isolés à partir d'une large gamme de niches, et elle est divisée en deux groupes principaux ^1,2. Le premier groupe comprend des organismes phytotrophique humaine, animale et, et la plupart des études ont porté sur les espèces pathogènes de ce groupe en raison de leur importance clinique. Les membres les plus pathogènes sont B. pseudomallei et B. mallei (qui provoque melioidosis et morve respectivement) ^3,4 et pathogènes opportunistes (les 17 espèces déterminées du complexe Burkholderia cepacia, BCC) ^5, qui causent la maladie de la fibrose kystique (FK) et granulomatose chronique (CGD) ^1. Le deuxième groupe, avec plus de 30 espèces non pathogènes, comprend bactéries associées aux plantes ou à l'environnement, et sont considérés comme potentiellement bénéfique à l'hôte ^2.

De nombreuses complications surgissent frinfection bactérienne om avec les éléments pathogènes du genre Burkholderia, tels que la transmission de l'agent pathogène entre les patients, la propagation de la maladie et l'échec du traitement en raison de la résistance intrinsèque ou acquise aux antibiotiques rend difficile à éliminer dans la plupart des cas, ^{de 6 à 9.} Par conséquent, acquérir une meilleure compréhension de la base pour l'établissement d'une infection bactérienne est essentiel pour le traitement des maladies causées par ces organismes. Afin de mieux comprendre la mise en place de l'infection, des enquêtes approfondies sur les composants bactériens associés à la pathogenèse sont nécessaires. Les études portant sur ​​l'analyse protéomique des organismes Burkholderia utilisant une approche protéomique décrits protéines qui ont été impliqués dans la pathogenèse bactérienne ainsi que des changements dans leur protéome Profils avec ^10-16.

méthodes d'extraction des protéines à l'aide de sonication et les cycles de gel-décongelés dans un tampon de lyse contenant une grande concentration de l'urée, de la thio-urée en combinaison avec un détergent et ampholytes a été appliquée dans des études protéomiques Burkholderia ^10-13. Bien que l'urée est tout à fait efficace pour la dénaturation des protéines, on peut établir un équilibre en solution aqueuse avec de l'isocyanate d'ammonium, qui peut réagir avec les groupes d'acides aminés, en formant ainsi des artefacts (réaction de carbamylation) ^17. Par conséquent, il est recommandé d'inclure des ampholytes porteurs, qui agissent comme piégeurs de cyanate et d'éviter des températures supérieures à 37 ° C ^17. En outre, pour éviter toute interférence chimique de tampon de lyse avec de la protéine quantification, le même tampon de lyse peut être utilisé pour générer la courbe d'étalonnage de telle sorte que les échantillons et les standards ont le même fond ^10. D'autres méthodes impliquent l'utilisation de tampons et détergents alcalins avec des périodes d'incubation de chaleur ^17,18, mais ces conditions pourraient induire des changements dans le protéome et certains détergents sont pas compatibles avec proteomics demande si des mesures ultérieures d'élimination de détergent sont inclus ^17,18.

Après l'extraction et la quantification adéquate, expression de la protéine globale de chaque protéine individuelle peut être étudiée en utilisant des approches protéomiques telles que deux dimensions (2-D) électrophorèse sur gel. Cette technique a été décrite par O'Farell ¹⁹ et consiste en la séparation des protéines en fonction de leur point isoélectrique par focalisation isoélectrique dans la première dimension, et ensuite en fonction de leur poids moléculaire par électrophorèse sur gel d'acrylamide dans la seconde dimension. En raison de sa sensibilité et de résolution, cette technique est un outil puissant pour l'analyse et la détection des protéines provenant de sources biologiques complexes ^19,20. Cette technique de séparation est actuellement disponible dans les approches de protéines centrée avec le grand avantage de résoudre isoformes de protéines causées par des modifications post-transcriptionnelles ou traitement protéolytique. Les changements quantitatifspeut être détectée en comparant l'intensité de la tache correspondant après coloration du gel ^20. Cependant, cette technique n'est pas adaptée pour l'identification de très grosses protéines, des protéines membranaires, des protéines extrêmement acides ou basiques et hydrophobes, et est une technique assez laborieux et prend du temps ^20. De nouvelles approches de peptides centrée (à base de gel non) qui sont plus robustes et objective deviennent disponibles et peuvent être utilisés pour la comparaison quantitative par des méthodes stable de marquage isotopique différentielles telles que l'étiquetage de la cystéine par affinité isotope codé marquage (ICAT) ^21, et un groupe amino étiquetage par isotopes marquage pour la quantification relative et absolue (iTRAQ) ^22. L'utilisation d'une technique de protéomique unique pourrait donner des informations insuffisantes, par conséquent l'utilisation de deux approches protéomiques complémentaires est nécessaire pour la plupart des changements évaluer pleinement dans protéome. Néanmoins, l'électrophorèse sur gel 2-D est largement utilisé et peut être appliquée de façon routinière pour la quanquantitatif expression de plusieurs protéines dans des organismes différents.

Nous décrivons ici une extraction de protéines à cellules entières et les procédures d'électrophorèse sur gel 2-D pour les espèces de Burkholderia qui ont été adaptés et optimisés à partir des 2-D Principes électrophorèse GE Healthcare et méthodes Manuel 80-6429-60AC 2004 ( www.amershambiosciences.com ). L'extraction de la protéine a été effectuée en utilisant un batteur de billes avec des billes de verre en présence de PBS contenant 5 mM d'EDTA (acide éthylènediamine tétraacétique) et 1 mM de PMSF (fluorure de phénylméthylsulfonyle). Cette procédure permet la quantification des protéines avec une dégradation minimale et est modifiable pour les approches protéomiques Comme indiqué précédemment ^15,23,24. Électrophorèse sur gel 2-D a été effectuée en utilisant 24 cm de long immobilisées pH 4-7 gradient et les protéines ont été séparées en fonction de leur point isoélectrique. Ensuite, les protéines ont été séparées en fonction de leur Molecpoids culier par gel SDS-polyacrylamide. De plus, nous avons décrit un procédé de coloration à l'argent pour la visualisation des protéines d'accompagnement, et un procédé de coloration à l'argent qui est compatible pour l'analyse par spectrométrie de masse. Ensemble, ces procédures peuvent permettre l'identification de protéines importantes d'espèces Burkholderia qui pourraient être impliqués dans la pathogenèse.