Summary

Memeli Hücreleri ile Derneği'nin Bakterilerin Canlılık belirlenmesi için Floresan Mikroskopi Yöntemleri

Published: September 05, 2013
doi:

Summary

Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir.

Abstract

Bakteriyel patojenez alanı merkezinde mikroplar ökaryotik hücrelere maruz kaldıktan sonra hayatta nasıl olursa ve tanımlamak için yeteneğidir. Bu soruları için geçerli protokollerin koloni sayımı tahlilleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobu. Koloni sayısı ve gentamisin koruma analizleri, yalnızca tüm bakteri nüfusunun canlılığını değerlendirmek ve bireysel bakteri canlılığını belirlemek mümkün değildir. Elektron mikroskobu ayrı ayrı bakterilerin yaşayabilirliği belirlemek ve ev sahibi hücrelerde lokalizasyon ile ilgili bilgi sağlamak için de kullanılabilir. Bununla birlikte, bakteriler sık ​​sık canlılığının değerlendirilmesi zor hale elektron yoğunluklarının bir aralığını gösterir. Bu makalede, iç ve konakçı hücreler ile ilgili ayrı ayrı bakterilerin canlılığı ortaya floresan boyaların kullanımı için protokolleri özetlenmektedir. Bu deneyler birincil insan nötrofillerinde Neisseria gonorrhoeae hayatta kalmasını değerlendirmek için ilk olarak geliştirilmiş, ancak bir olmalıbir bakteri konakçı hücre etkileşimine pplicable. Bu protokoller, zar geçirgen floresan boyalar birleştirmek için erişilebilir membran geçirmeyen floresan boyalar (propidyum iyodür ve SYTOX Green) ile, tüm bakterileri leke (SYTO9 ve 4 ',6-diamidino-2-fenilindol [DAPI]) cansız bakteri. Önceki ökaryotik hücre nüfuziyet için, bir antikor ya da tepkin madde flüoresan hücre dışı bakteri belirlemek için ilave edilmektedir. Bu nedenle, bu deneyler, ökaryotik hücrelere ve iç yapışık bakteri canlılığı ayırt edebilir. Bir protokol, aynı zamanda ayrı ayrı bakterilerin hücre içi lokalizasyonu belirlemek amacıyla, ökaryotik hücre işaretleyicileri için floresan antikorlar ile kombinasyon halinde canlılığı boyalar kullanılarak sağlanır. Bu makalede açıklanan bakteriyel canlılığı boyalar ayrı ayrı bakterilerin canlılığı değerlendirmek ve bakteri konakçı hücre hayatta burada ile ilgili bilgi sağlamak için, geleneksel teknikler mikrobiyoloji için hassas bir tamamlayıcı ve / veya alternatifs.

Introduction

Dinamik bir etkileşim ve ikamet ettikleri bakteri ve bilgisayarlar arasında işbirliği evrim vardır. Bakteriler bağlılık organellere, salgı sistemleri ve / veya konak fagositik ve fagositik olmayan hücrelerin kendi üretken enfeksiyon etkinleştirmek toksin üretme yeteneği gelişmiştir. Bakteriler de tanıma ve konakçı bağışıklık sisteminin antimikrobiyal aktiviteleri ile uğraşmak gerekir. Ev sahibi, bağışıklık sistemi, fiziksel ve kimyasal engeller, bağışıklık hücreleri, tamamlayıcı sistemin, ve humoral bağışıklık diğer bileşenleri de dahil olmak üzere doğal ve adaptif bileşenden oluşur. Birçok bakteri tabakalı konak immün tepkisi ile öldürülmesi ve temizlik duyarlı olsa da, bazı patojenik ve fırsatçı bakterilerin konakçı hücrelerin çeşitli enfekte ve konak immün cevabı 1 ile açıklık bozmak için mekanizmalar geliştirmişlerdir. Neisseria gonorrhoeae bakteriyel patojen bir örneğidir Bu son derece insan konak. Yok inat uyarlanmıştır. gonorrhoeae kolayca ürogenital sistem, yutak, konjonktiva ve rektum mukoza epitelyal hücrelerin luminal yüzeyleri kolonize. Kolonizasyon mukozal sitelerde nötrofillerin bol işe tetikler. Nötrofiller mikroorganizmaları öldürmek için antimikrobiyal süreçlerin çeşitli sahip profesyonel fagositlerdir, ancak, N. gonorrhoeae nötrofillerin 2-5 mevcudiyetinde hayatta kalma yeteneğine sahiptir. Böyle N. nasıl gibi bakteriyel patojenler Anlamak gonorrhoeae, yıkmak bastırmak ve sonuçta normalde düşman konak ortamlarda hayatta kalmak için bağışıklık tepkisini kaçırmak bulaşıcı hastalıklarla mücadele için yeni tedavilerin geliştirilmesi için çok önemlidir.

Genellikle konakçı hücreler bakteriyel hayatta araştırmak için kullanılan deneysel protokol koloni sayısı deneyleri, gentamisin koruma tahlilleri ve elektron mikroskobu. Koloni sayısı deneylerinde, enfekte olmuş hücrelerin bir popülasyonu wh bir deterjan ile, örneğin, (parçalananaich bakteriler bakteri serbest bırakmak için) dirençlidir. Lizatlar seyreltildi ve agar bazlı ortam üzerine plakalanmıştır ve lizatlardaki koloni oluşturucu birim, her bir zaman noktasında ve / veya deney koşulu için numaralandırılır edilir. Bu yaklaşım, tüm bakteri nüfusunun canlılığı bildirir ancak hücre içi ve hücre dışı yaşam arasında ayırım yeteneğine sahip değildir. Koloni sayımı tahlili, gentamisin koruma deneyinde, bir varyasyonu özellikle ökaryotik plazma zarı 6 geçmeye antibiyotik gentamisin yetersizlik dayalı hücre içi bakteri hayatta, ölçer. Bununla birlikte, bu deney, gentamisin (ya da benzer bir ökaryotik membran geçirgen olmayan başka bir antibiyotik) ile iç bakterilere erişmek için antibiyotiğin yetersizlik ile öldürmeye karşı hassas olan bakteri bağlıdır. Bu nedenle, bir gentamisin koruma deneyi, tüm bakteri türlerinin incelenmesi için etkili ya da başka yüksek bakteriyel hayatta incelerkennötrofiller gibi pinocytic hücreleri. (Bakteri agrega ya da farklı bireysel bakteriyel hücrelerden davranır mikrokoloniler formu ise gibi) bu yaklaşımların hiçbiri hücre içi lokalizasyonu ya da ayrı ayrı bakterilerin diğer davranışları ortaya koymaktadır. Tek tek dış ve iç bakteri canlılığı incelemek için sıkça kullanılan bir başka yaklaşım, ince kesitli transmisyon elektron mikroskobu (TEM) 'dir. Bu yaklaşım daha fazla hücre içi işaretleri karşı altın bağlanmış antikorları ile immunoelectron mikroskobu ile incelenmiştir edilebilir konakçı hücrelerde bakterilerin yere (örneğin, fagosom, sitoplazma, autophagosome), ilgili bilgi sağlayabilir avantajlıdır. Bununla beraber, elektron mikroskobu bakteri uygunluğu değerlendirmek özellikle duyarlı değildir. Gömülü bölümler uranil asetat, kurşun sitrat veya diğer elektron yoğun reaktifleri ile boyanmış ve elektron mikroskopi ile görüntülenmiştir zaman, elektron-yoğun bakteri uygun ve elektrik olarak kabul edilirtron-Lucent cansız 7,8. Ancak, bu varsayım ciddi biçimde kesintiye membranların ve sitoplazma yoksun olan sadece bu ölü bakteri beri elektron-Lucent görünür, bakteri canlılığı overestimates. Ayrıca, bazı bakteri türlerinin zor canlılığını belirlemek için yapım büyüme aşamasına bağlı olarak, kendi elektron yoğunluklarının bir aralığını görüntüleyebilir.

Alternatif bir ya da bu yaygın olarak kullanılan yöntemlere ilave olarak olduğu gibi, burada eklenmiş ve konak hücreleri ile içeride bakterilerin hayatta kalmasını değerlendirmek için bakteriyel canlılığı göstermektedir floresan boyaların kullanımı için protokoller ve mantığını sağlar. Hücre dışı bakteriler belirlemek için, enfekte olmuş hücreler, ilk olarak bir lektin ya da bakteri özgü antikor gibi bir flüoresan tepkime maddesi, maruz kalmaktadır. Enfekte edilen hücreler daha sonra geçirgen ve bakteriyel canlılığı için bir vekil olarak, bozulmuş membran vs bozulmamış bakterilere farklı olarak erişilebilir DNA özgü boyalar maruz kalmaktadır. İlk olarak ppropidium iyodür membranlar tehlikeye ve böylece cansız kabul edilen bu bakterilerin sadece erişilebilir ise otokol, membran geçirgen boya SYTO9, toplam bakteri nüfusu tanımlar. Propidium iyodür ve SYTO9, Biyofilmlererde bakteri canlılığı değerlendirmek patojenik bakterilerin patojenik ayrımcılık ve uygulanabilir su-kaynaklı bakteri 9-12 numaralandırmak için kullanılır olmuştur. SYTOX Green cansız nüfusa erişilebilir iken, ikinci protokolde, 4 ', 6'-diamidino-2-fenilindol (DAPI), toplam bakteri tanımlar. Bu canlılığı boya çifti bakteriyel hücre içi lokalizasyonu tanımlamak Örneğin, ilgi konusu bir protein ile ilgili olarak her bir bakterinin yerini belirlemek için bağışıklık ile kombine edilebilir. Bu tahlillerin kullanılması konak hücrelerin enfeksiyonu esnasında bakteri öldürme veya hayatta kalması ile sonuçlanabilir etkileşimler içine önemli bilgiler sağlar. Bu makalede anlatılan protokoller canlılığı ve değerlendirmek için kullanılmıştırNötrofil phagosomes 5,13,14 farklı toplumlarda da dahil olmak üzere temel insan nötrofil, ve içine bağlanmış olup, N. gonorrhoeae. Bununla birlikte, bu protokoller profesyonel fagositlerin, non-profesyonel fagositlerin ve protozoa 15-24 gram-pozitif ve gram-negatif bakterilerin uygulanabilirliğini değerlendirmek için uygulanabilir.

Protocol

1.. Propidium iyodür ve SYTO9 ile Bakteriyel Canlılık Değerlendirilmesi Ilgi bakteri ile 24 yuvalı plakalar içinde 12 mm çapında yuvarlak cam lameller yapışık olan hücreleri, Infect. Aldehid veya organik çözücüler ile hücreleri tamir yapmayın. Bir kez yavaşça hücreleri yıkayın 0.1 M 3 – (N-morfolino) 1 mM MgCI2 (MOPS / MgCI2) ihtiva eden propanesülfonik asit (MOPS), pH 7.2,. Dış bakteri tespit etmek için, MOPS / MgCI2</…

Representative Results

Belirtilen protokoller N. hayatta kalma incelemek için kullanılmıştır gonorrhoeae primer insan maruz kaldıktan sonra 5,26 nötrofil. Nötrofiller N. ile enfekte edildi gonore ve yeşil floresan canlılığı boya SYTO9 ve kırmızı floresan propidiyum iyodür (Şekil 4A) kullanılarak, protokolü 1 ile işlenir. Boyalar tercihen ev sahibi hücre, plazma zarının değil, N. geçirgenliği için kolesterol tecrit saponin varlığında ilave e…

Discussion

DNA, insan hücrelerine ve içine bağlanmış canlı ve ölü bakteri belirlemek için bir flüoresan lektin ile bağlantılı olarak bağlanması ve canlılığı boyalar kullanan iki protokol burada sunulmuştur. Her iki protokol etkili ölü bakteri canlı ayırmak için, kullanımı protokol seçimi denemenin hedefi bağlıdır. Birinci protokol cansız bakteri ve sağlam bakteri tespit etmek için tespit SYTO9 propidiyum iyot kullanmaktadır. Şekil 4A'da gösterilen N bulaşmış ins…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Biz yazının eleştirel okuma için Asya Smirnov ve Laura Gonyar teşekkür ederim. Bu çalışma AKCMBJ hibe NIH R00 ve R01 TW008042 AI097312 NIH T32 AI007046 tarafından kısmen desteklenen tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name of Reagent/Material Company Catalog Number Comments
21 G 3/4 butterfly needles for blood collection Becton Dickinson 367251
Blood collection tubes with Sodium Heparin 10 ml Becton Dickinson 366480
Sterile water for irrigation Baxter 07-09-64-070
Dextran 500 Sigma 31392
Sodium Chloride Fisher Scientific S641
Dextrose Ricca Chemical Company RDCD0200
Dulbecco's PBS no Ca2+ or Mg2+ Thermo Scientific SH3002802
Ficoll solution GE Healthcare 17-1440-03
Acetic Acid Fisher Scientific BP2401
12 mm circular glass coverslips Fisher Scientific 12-545-80 12CIR-1
24-well plates Corning Incorporated 3524
Pooled Human Serum Sigma S7023
RPMI Mediatech 15-040-CV
Fetal Bovine Serum Thermo Scientific SH3007103
Human interleukin-8 R&D Systems 208-IL/CF
MOPS Sigma M3183
MgCl2 Fisher Scientific BP214
Propidium Iodide Life Technologies L7007 or L7012
SYTO9 Life Technologies L7007 or L7012
Saponin Fluka Analytical 47036
Alexa Fluor 647-coupled soybean lectin Life Technologies L-32463
DAPI Sigma D8417
SYTOX Green Life Technologies S7020
Mouse anti-CD63 Developmental Studies Hybridoma Bank H5C6
Alexa Fluor 555 Antibody Labeling Kit Life Technologies A20187
Hemacytometer Bright Line Hausser Scientific 1492
Forceps EMS 78320
Sorvall Legend RT + Centrifuge Thermo Scientific 75004377

References

  1. Woolard, M. D., Frelinger, J. A. Outsmarting the host: bacteria modulating the immune response. Immunol. Res. 41, 188-202 (2008).
  2. Johnson, M. B., Criss, A. K. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to neutrophils. Front Microbiol. 2, 77 (2011).
  3. Simons, M. P., Nauseef, W. M., Apicella, M. A. Interactions of Neisseria gonorrhoeae with adherent polymorphonuclear leukocytes. Infect. Immun. 73, 1971-1977 (2005).
  4. Seib, K. L., et al. Investigation of oxidative stress defenses of Neisseria gonorrhoeae by using a human polymorphonuclear leukocyte survival assay. Infect. Immun. 73, 5269-5272 (2005).
  5. Criss, A. K., Katz, B. Z., Seifert, H. S. Resistance of Neisseria gonorrhoeae to non-oxidative killing by adherent human polymorphonuclear leucocytes. Cell Microbiol. 11, 1074-1087 (2009).
  6. Edwards, A. M., Massey, R. C. Invasion of human cells by a bacterial pathogen. J. Vis. Exp. (49), e2693 (2011).
  7. Bozzola, J. J. Conventional specimen preparation techniques for transmission electron microscopy of cultured cells. Methods Mol. Biol. 369, 1-18 (2007).
  8. Dorward, D. W. Ultrastructural analysis of bacteria-host cell interactions. Methods Mol. Biol. 431, 173-187 (2008).
  9. Yang, L., et al. Rapid, absolute, and simultaneous quantification of specific pathogenic strain and total bacterial cells using an ultrasensitive dual-color flow cytometer. Anal. Chem. 82, 1109-1116 (2010).
  10. Mueller, R. S., et al. Vibrio cholerae strains possess multiple strategies for abiotic and biotic surface colonization. J. Bacteriol. 189, 5348-5360 (2007).
  11. Shen, C., et al. Enhanced inactivation of Salmonella and Pseudomonas biofilms on stainless steel by use of T-128, a fresh-produce washing aid, in chlorinated wash solutions. Appl. Environ. Microbiol. 78, 6789-6798 (2012).
  12. Hoefel, D., Grooby, W. L., Monis, P. T., Andrews, S., Saint, C. P. Enumeration of water-borne bacteria using viability assays and flow cytometry: a comparison to culture-based techniques. J Microbiol Methods. 55, 585-597 (2003).
  13. Oh, H., Siano, B., Diamond, S. Neutrophil isolation protocol. J. Vis. Exp.. (17), e745 (2008).
  14. Allen, L. A. Immunofluorescence and confocal microscopy of neutrophils. Methods Mol Biol. 412, 273-287 (2007).
  15. Kaplan, E. L., Chhatwal, G. S., Rohde, M. Reduced ability of penicillin to eradicate ingested group A streptococci from epithelial cells: clinical and pathogenetic implications. Clin. Infect. Dis. 43, 1398-1406 (2006).
  16. Chow, O. A., et al. Statins enhance formation of phagocyte extracellular traps. Cell Host Microbe. 8, 445-454 (2010).
  17. Thulin, P., et al. Viable group A streptococci in macrophages during acute soft tissue infection. PLoS Med. 3, e53 (2006).
  18. Kubica, M., et al. A potential new pathway for Staphylococcus aureus dissemination: the silent survival of S. aureus phagocytosed by human monocyte-derived macrophages. PLoS One. 3, (2008).
  19. Swords, W. E., et al. Mycobacterium xenopi multiplies within human macrophages and enhances HIV replication in vitro. Microb. Pathog. 40, 41-47 (2006).
  20. Tamilselvam, B., Almeida, R. A., Dunlap, J. R., Oliver, S. P. Streptococcus uberis internalizes and persists in bovine mammary epithelial cells. Microb. Pathog. 40, 279-285 (2006).
  21. Martinez, A. N., et al. Molecular determination of Mycobacterium leprae viability by use of real-time PCR. J. Clin. Microbiol. 47, 2124-2130 (2009).
  22. Botha, M., Botes, M., Loos, B., Smith, C., Dicks, L. M. Lactobacillus equigenerosi strain Le1 invades equine epithelial cells. Appl. Environ. Microbiol. 78, 4248-4255 (2012).
  23. Allen, L. A., Schlesinger, L. S., Kang, B. Virulent strains of Helicobacter pylori demonstrate delayed phagocytosis and stimulate homotypic phagosome fusion in macrophages. J. Exp. Med. 191, 115-128 (2000).
  24. Smith, C. D., Berk, S. G., Brandl, M. T., Riley, L. W. Survival characteristics of diarrheagenic Escherichia coli pathotypes and Helicobacter pylori during passage through the free-living ciliate, Tetrahymena sp. FEMS Microbiol. Ecol. 82, 574-583 (2012).
  25. Morse, S. A., Bartenstein, L. Purine metabolism in Neisseria gonorrhoeae: the requirement for hypoxanthine. Can. J. Microbiol. 26, 13-20 (1980).
  26. Johnson, M. B., Criss, A. K. Neisseria gonorrhoeae phagosomes delay fusion with primary granules to enhance bacterial survival inside human neutrophils. Cell Microbiol. , (2013).
  27. Stocks, S. M. Mechanism and use of the commercially available viability stain. BacLight. Cytometry A. 61, 189-195 (2004).

Play Video

Cite This Article
Johnson, M. B., Criss, A. K. Fluorescence Microscopy Methods for Determining the Viability of Bacteria in Association with Mammalian Cells. J. Vis. Exp. (79), e50729, doi:10.3791/50729 (2013).

View Video