前立腺癌におけるバイオマーカーの発見への応用：個々のHERV座発現のマイクロアレイベースの識別

1。手術外科医によって除去されると病理学者が担当して取られるまで、氷上で前立腺を維持する。 2。前立腺組織の取り扱い周術期虚血の遅延を尊重し、外科的切除後の30分以内に、専用のスタッフが研究室に氷上で根治的前立腺切除術の標本を転送します。凍結の遅延は、以下で20〜30分（ 図3A）である必要があります。 （左側の黒い右側例えば緑、 図3Bおよび3C参照 ）通常のプロトコルに従って、前立腺を計量して染色。 後部側の腺（ 図3D）の大規模な横断面を実行します。前立腺を方向付けし、前側の上に置いた。無菌メスで後部側の腺の大横断面を実行します。 遷移領域での組織片を解剖、（ 図3E）は無傷の余白を残して、左右の周辺ゾーン、上。 エッペンドルフチューブに組織のコアを入れ、液体窒素（ 図3F）で凍結して保存スナップ。あなたは行っていない場合はバイオバンクは、ステップ2.7に進んでください。 生検での癌の全長が10ミリメートルよりも優れている場合にのみ、前立腺バンキングを行う。前立腺を閉じるには、グランド歪みや切除断端（ 図3G）の最小限の中断を防ぐために、縫合糸を使用しています。その後、組織学的分析のための通常の手順に従ってパラフィンにホルマリンとembedで根治的前立腺標本を固定します。 10月の小さなマウンド上に垂直に凍結した組織コアをマウントし、クライオスタット内のセクションを作る。最初のシングルは5μm凍結切片を取り、トルイジンブルーでそれを染色。 （ すなわち 。良性または悪性）組織の性質を分析するために迅速な組織学的検査を行う。腫瘍のため組織は、腫瘍細胞の量を推定し、腫瘍細胞の80％以上でのみコアを選択します。 これに続いて、ニューシングル5μmの凍結切片を行い、ヘマトキシリン​​、エオシン及びサフランでそれを染色。その後、X 30〜15μmの部分をカットし、RNA分解酵素フリーのエッペンドルフチュー​​ブに入れてください。 ヘマトキシリン​​、エオシンおよびサフランのための最後の5ミクロン凍結切片を取り、手順の最後に腫瘍細胞の量を制御するために、それを染色。 ドライアイスでエッペンドルフチュー​​ブを入れて、分子生物学の研究室にサンプルを送ってください。 3。 RNAを抽出、精製、および品質管理均質化。組織が完全に溶液に溶解されるまでTrizol/100 mgの組織を1mlの存在下での均質化を行う。徐々にトリゾールソリューションを追加し、ハンドヘルドグラインダーを用いて氷上でのケアを進める。一回均質化し、エッペンドルフチュー​​ブにソリューションをアリコートを室温でトリゾールに残し5分。 相分離。 300μlのクロロホルム（または150μLBCP/1.5ミリリットルトリゾール）を追加します。ボルテックス15秒後、2〜3分間室温で残す。 2〜8℃で15分間、12,000×gで遠心分離 RNA沈殿。新しいチューブに慎重に上部の水相を転送します。 750μlのイソプロパノールを追加します。 10分（戻入により攪拌）を、室温でインキュベートする。 ℃でC/-31°-19で2時間インキュベートする2〜8℃で30分間12,000 xgで遠心分離器のサンプル RNAの洗浄とサスペンション。遠心分離後、上清を除去します。 1ミリリットル80パーセントエタノール（優しくチューブを逆に）で洗浄し、RNAペレット。 2〜8℃で10分間7500×gで遠心分離器のサンプルP1000とP10を用いて上清を取り除きます。 2〜3分間空気乾燥エタノールを残り許す。 70℃のヒートブロックに100μlのRNaseフリー水、移送チューブを追加し、ペレットを溶解するために2〜3分間放置します。その後、氷の上に置く。短期記憶のためのC°C/-31°-19で保存して -長期保存のために80°C。 RNA精製。をRNeasy Miniキット（Qiagen）を用いてRNAを精製する。キアゲンの手順に従って、簡単に言えば、100μlのRNAサンプルに350μlのバッファーRLTを追加することから始め、よく混ぜる。最終的には、品質管理（ステップ3.6）のために精製された生成物の3μL（50μLのうち）アリコートを取る。で保管してRNAを-19°C/-31°Cの短期期間や長期保存のために-80℃で。 RNAのQC（ 図4A）。製造者の指示に従って、RNAの品質やバイオアナライザ（アジレント）とナノドロップ（サーモ）を使用して、RNAの完全性を確認してください。 RNA完全性番号（RIN）は、RNAの品質を評価するために使用される。具体的には、18Sおよび28Sピークの検出に成功して強く更なるステップでサンプルを使用することをお勧めします。 4。 WT-オベーションRNA増幅 WT-OVを用いた増幅ステップを実行するための推奨事項最適な条件でのATION増幅キット： ピペットの精度を確保するために一度に8増幅サンプルよりも少ないを実行しない。 8反応の3バッチにキットの分割を必要とするマスターミックスを準備するときに、1廃棄物の量を占めている。 特に指示がない限り、常に氷上で融解試薬および反応チューブを保持します。 精製のための唯一の新鮮な80％エタノール溶液を使用する。 プロトコルのどの段階で停止しないでください。 25 NG /μLの濃度を得るために、全RNAを希釈します。希釈した試料の2μLを処理します。 1:25,000希釈を達成するために、ポリ-RNAスパイクインコントロールソリューションポリコントロール希釈バッファー（Affymetrix社）とポリA RNAの株式の連続希釈によりを準備します。 ステップ1：第一鎖cDNA合成4.3から4.8。次のように述べた試薬は、供給者によって参照される。A1（ファーストストランドプライマーミックス）、A2（FIRSTストランドバッファーミックス）、A3（ファーストストランド酵素ミックス）。 室温でA1とA2を解凍する。 2秒2秒、スピンボルテックス·ミキサーを用いて混合します。その後、すぐに氷上に置きます。氷の上のA3を配置します。 0.2ミリリットルのPCRチューブに全RNA（50 NG）の2液を入れて、A1の2液（最終容量：4μL）を追加します。キャップと2秒間チューブをスピン。 その後、チューブを氷上に置いて5分間65℃でインキュベートする。 （単一反応のために与えられた）は、以下のように第一鎖cDNAのマスターミックスを準備します。ピペッティングにより混合し、マスターミックスを簡単にスピンダウン。すぐに、氷の上に置きます。 試薬ボリューム第一鎖バッファーミックス（A2） 5μL ポリA RNAコントロール（1:25,000） 0.5μL 第一鎖酵素ミックス（A3） 0.5μL 追加6＆＃181; RNA /プライマーを含むチューブにマスターミックスのL。 2秒間のチューブ、スピンをフリックで混合し、すばやく氷（最終容量：10μL）に配置します。 15分間、10分間、その後70℃で、次いで42℃、10分間、次いで25℃、1分間、4℃でインキュベートする。 4℃で、冷静さを保つサーマルサイクラーから反応管を取り外して、簡単にスピンし、氷上に保つ。第二鎖cDNA合成ステップですぐに続ける。 ステップ2：第二鎖cDNA合成4.8から4.12。 B1（第二鎖バッファーミックス）とB2（第二鎖酵素ミックス）を次のように述べた試薬は、供給者によって参照される。 2秒間B2、B3はスピンダウンし、すぐに氷上に置きます。室温でB1を解凍する。 、2秒間ボルテックスミキサーを使用してミックス2秒間スピンし、すぐに氷上に置きます。 （単一反応のために与えられた）は、以下のように第二の鎖マスターミックスを準備します。ピペッティングにより混合し、マスターミックスのブリーチーズをスピンダウン飛ぶ。すぐに、氷の上に置きます。 試薬ボリューム第二鎖緩衝液ミックス（B1） 9.75μL 第二ストランド酵素ミックス（B2） 0.25μL 各第一鎖反応チューブにマスターミックス10μlを加える。 3X、氷上で2秒と場所（：20μL最終容量）のためのスピンをピペッティングして混ぜる。 5分間、30分間、次いで50℃で10分間、次いで25°C、1分間4℃でインキュベートし、その後70°C。 4℃で、冷静さを保つサーマルサイクラーから反応管を取り外して、簡単にスピンし、氷上に保つ。ポスト第二の鎖の強化の段階ですぐに続ける。 ステップ3：ポスト第二の鎖の強化4.13から4.15。 B1（第二鎖バッファーミックス）、B3（反応の強化酵素ミックス）を次のように述べた試薬は、供給者によって参照される。 </p> （単一反応のために与えられた）、次のようにB1とB3のミックスを組み合わせることにより、マスターミックスを準備します。ピペッティングにより混合し、マスターミックスを簡単にスピンダウン。すぐに、氷の上に置きます。 試薬ボリューム第二鎖緩衝液ミックス（B1） 1.9μL 反応エンハンスメント酵素ミックス（B3） 0.1μL 各第二鎖反応チューブにマスターミックスの2を添加する。 3X、氷上で2秒と場所（：22μL最終容量）のためのスピンをピペッティングして混ぜる。 20分間、15分間、次いで37℃、1分間、4℃でインキュベートし、次いで80℃。 4℃で、冷静さを保つサーマルサイクラーから反応管を取り外して、簡単にスピンし、氷上に置きます。 SPIA増幅工程と、すぐに続けています。 ステップ4：4.16からSPIA法による単鎖cDNA（sscDNAを）合成-4.19。 C1（SPIAプライマーミックス）、C2（SPIAバッファーミックス）、C3（SPIA酵素ミックス）を次のように述べた試薬は、供給者によって参照される。 室温でのC1とC2を解凍する。 2秒間ボルテックスミキサー、スピンを使用して、すぐに氷上に置いて混合する。氷の上のC3を解凍する。優しく5Xを反転させたコンテンツを混ぜる。気泡を導入しないことを確認してください。その後、氷上で2秒、場所をスピン。 以下のように、0.5廃棄物の量を占め、SPIAマスターミックスを調製する。ピペッティングにより混合し、マスターミックスを簡単にスピンダウン。すぐに、氷の上に置きます。 試薬ボリューム SPIA-バッファ·ミックス（C2） 5μL SPIA – プライマーミックス（C1） 5μL SPIA-酵素ミックス（C3） 10μL 強化された第二鎖反応tにSPIAマスターミックス20μLを追加UBE。 6-8X、スピンをピペットで混合し、すばやく氷上で（最終容量：42μL）を配置します。 5分間、60分間、その後95℃で、次いで47℃、1分間、4℃でインキュベートする。 4℃で、冷静さを保つサーマルサイクラーからチューブを取り外し、簡単にスピンし、氷上に置きます。 5。 sscDNAを精製および品質管理 sscDNAを精製。 QIAquik PCR精製キット（Qiagen）を用いてsscDNAを精製する。簡単に説明すると、増幅されたcDNA産物の42μlに200μlのBuffer PBを追加することから始め混ぜてカラム上にロードします。それからキアゲン手順に従ってください。最終的には、品質管理（ステップ5.2）のためのsscDNAを精製した生成物の3μL（30μLのうち）アリコートを取る。 （ 図4B）を得、サイズ分布sscDNAを確認。製造者の指示に従って、sscDNAを収率およびバイオアナライザおよびナノドロップを使用して粒度分布を確認してください。増幅されたcDNAの分布の大きさは、aがb必要がありますEは、一般的に600塩基付近にピークとの長い100〜1,500塩基の間で構成される。 6。 sscDNAを断片化ヌクレアーゼフリー水で容量を調整し、30μlのcDNAを2μgのを準備します。 10倍のOPAバッファーPLUSソリューションから始めて、1×ワンPHOR-すべてのバッファープラス（OPA）を準備します。 0.2 U /μlのDNA分解酵素を準備し、I（1 U /μLのDNase Iの5倍希釈）。 以下のように（単一反応のために与えられた）断片化マスターミックスを準備します。 試薬ボリューム 10XワンPHOR – すべての緩衝液+ 3.6μL DNアーゼI（0.2 U /μL） 3μL sscDNAを30μlに断片化ミックスの6.6を添加する。 スピンし、次いで10分間95℃でのDNase Iを不活性化し、氷上に置き、10分間37℃でインキュベートする。分量1＆＃181;アジレント·ベースのサイズ分布を検証するための断片化されたcDNAのlである。 sscDNAをサイズ分布の確認（ 図4C）。バイオアナライザ（アジレント）を使用して、sscDNAをサイズ分布を確認してください。断片化されたcDNAのサイズ分布は、一般的に35と200塩基の間に含まれるべきである。 7。断片化されたsscDNAをの標識のDEPC水に5 mMまでDLR-1A 7.5ミリメートル希釈する。 以下のように（単一反応のために与えられた）ラベルマスターミックスを準備します。 試薬ボリューム 5XのTdT反応バッファー 14μL のCoCl 2（25 mM）を 14μL DLR-1A（5ミリモル） 1μL ターミナルトランスフェラーゼ（400 U /μL） 4.4μL 標識ミックスの33.4μl加え各断片化されたcDNAサンプルである。 氷上で保管した後、簡単にスピンし、60分間37℃でインキュベート、チューブをフリックで混ぜる。 8。 HERVチップマイクロアレイへのハイブリダイゼーションプレハイブリダイゼーションミックス（Affymetrix社）200μlとのHERVのGeneChipを予め湿らし、10分間、50℃、60 rpmでインキュベートする。 （単一反応のために与えられた）は、以下のようにハイブリダイゼーション混合物を準備します。 試薬ボリュームコントロールオリゴB2（3nMの） 3.3μL 20X真核生物のハイブリダイゼーションコントロール 10μL 2Xハイブリダイゼーションミックス 100μL 99.9％のDMSO 17.7μL 最終的なVOを作るために、室温で断片化し、標識されたcDNAの69μlにハイブリダイゼーションミックスの131μLを追加200μLのLUME。 混合し、95℃で2分間変性させ、次いで5分間、最大速度で5分間遠心し、50℃でインキュベートする。 予め湿らせHERV遺伝子チップを空にし、200μlのターゲット調製をロードします。 2セプタムにタフなスポットを適用します。 18時間、50°C、60rpmでハイブリダイズする。 18時間後、HERVの遺伝子チップを空にして、4℃で収集されたハイブリダイゼーション溶液を保存するチップはすぐに流体工学に実行されていない場合は4℃で保存し、250μlの洗浄緩衝液Aとプローブアレイを埋める 9。洗浄·染色 GCOSのメニューバーから流体工学を実行します。流体工学]ダイアログボックスで、目的の駅を選択（1から4）には、すべてのモジュールのShutdown_450を選択し、[ファイル名を指定して実行。ミリQ水に3流体工学吸引ラインを浸す。液晶画面の指示に従ってください。 すべてのモジュールにPrime_450プログラムを適用します。洗浄バッファーAのためのチューブを置きます400ミリリットル洗浄バッファーAを含む哺乳瓶、および200ミリリットル洗浄バッファーBを含むボトル内の洗浄緩衝液Bの1その後、再び、液晶画面の指示に従ってください。 針を持ち上げて600μlの染色カクテル1（SAPEソリューションミックス）と600μlの染色カクテルを置く2（抗体液ミックス）位置＃1、＃2で、マイクロ遠心チューブを含有し、800μlの配列が位置＃3の緩衝液を保持する。 各モジュールに右のチップを割り当て、FS450-004プロトコルを選択し、各モジュールを実行し、画面の指示に従います。 10。スキャニング GS3000スキャナをウォームアップ。これは、ライトが緑色に変わったときにスキャンする準備ができています。 直接スキャナーにオートローダにまたは代わりにチップをロードし、リークを防ぐためにセプタム上にタフなスポットを適用します。スキャンを開始します。 チップをスキャンした後、。CELファイルが生成されます。 <画像を確認し、プローブ細胞を（識別するためにスポットにグリッドを揃える強い>フィギュア4D-F）。 11。データ解析品質管理。標準アフィメトリクスを参照して下さいHERV-V2チップは品質管理基準を満たしているかどうかを確認するように制御する。この目的のために、次の表現を使用することができる。強度の中央値に対する対数強度値分布（密度プロットおよびボックスプロット）、中央絶対偏差（MAD）（MAD-メッド）をプロットし、背景プロット、正規化されスケーリングされていない標準誤差（NUSE）プロットと相対対数発現（RLE）のプロット。 正規化。また、データセットは、予想外のバッチ効果を強調するために、統計分析の前にそれらを修正する検討されるべきである。データの前処理は、このようにバックグラウンド補正（ 例 。トリプトファンプローブベースライン信号に基づいて）、RMAの正規化および要約15に続いています。 データマイニングと差分的に発現される遺伝子を検索します。チップを正常化し、階層的クラスターと適用データセット（ 図6A）探索するのNGアプローチ。その後、マイクロアレイの古典の重要な分析（SAM）偽発見率（FDR）補正17に続いて手順16を使用して示差的に発現された遺伝子（DEG）の検索を実行します。これらのステップは、完全のPartek GSのようないくつかのソフトウェア解析·スイートに統合されているが、代わりにバイオコンダクタープロジェクト19のパッケージによりR統計ソフトウェア18を使用して行うことができることに注意してください。統計分析の後、発現値が2未満であるために6個のプローブセットを除外したデータセットをフィルタ処理する。 可視化と解釈。注釈データベースを使用して専用のインターフェースにおけるHERV-V2マイクロアレイから得られた結果を解釈する。