Ориентированного подхода отбора материала для разработки полученных золь-гель белка легированных микрочипов использованием новых пин-печать способ изготовления описан. Эта методика продемонстрирована путем разработки ацетилхолинэстеразы и мультикиназный микрочипов, которые используются для экономически эффективного малые молекулы скрининга.
Microarrays нашли применение в развитии высокой пропускной способностью для анализа новых материалов и открытие малых молекул приводит препарата. Здесь мы описываем управляемый подход скрининга для идентификации материала золь-гель на основе материалов, которые пригодны для получения трехмерных микрочипов белка. Подход сначала идентифицирует материалов, которые могут быть напечатаны в виде микрочипов, сужает количество материалов путем определения тех, которые совместимы с данным ферментативного анализа, а затем в камень на оптимальных материалов на основе удержания максимальной активности фермента. Этот подход применяется для разработки микрочипов подходит для двух различных анализах фермент, один использованием ацетилхолинэстеразы, а другой с помощью набора из четырех ключевых киназ, участвующих в рак. В каждом случае можно было производить микрочипы, которые могут использоваться для количественного малые молекулы скрининга и производства зависит от дозы кривые ингибитор реакции. Важно отметить, что способность экранировать многие матриалов подготовил информацию об виды материалов, которые лучше всего подходят как производства микрочипов и сохранения активности ферментов. Материалы данные дают представление основных требований материала, необходимого для пошива оптимальный высокой плотности полученных золь-гель микрочипов.
Microarrays завоевали популярность в научном сообществе как способ увеличения пропускной анализа. С развитием технологии микрочипов для оценки экспрессии генов 1 в середине 1990-х, микрочипы нашли применение в развитии высокой пропускной анализов для выявления белок-белковых и белково-Малые взаимодействия молекул и найти новых материалов с уникальными свойствами. 2-5 Совсем недавно микрочипов были разработаны котором конкретные материалы используются для иммобилизации функциональных белков, образуя трехмерную микрочипов элемент, в котором белки захватываются, что обеспечивает легкое измерение ферментативной активности и ингибирование микрочипов себя, используя подходящий флуоресценции анализ, который соединен с подложкой оборота. 5-10 Важно отметить, что такие микрочипы могут быть разработаны, чтобы включить все компоненты, необходимые для скрининга образцов и контролей вместе в высшей степени параллельно моды. 5,8 </ P>
Ранние примеры белка микрочипов, как правило, получают с использованием стандартных методов иммобилизации белков на твердые носители, такие как ковалентное присоединение, 11 сродства захвата 3 и физической адсорбции. 12 Хотя эти методы биологической иммобилизации позволяет увеличить концентрацию образца и ускоренного кинетика реакции необходимы для Анализ миниатюризации, каждый из них страдает недостатками. В общем, все вызывают снижение родной биомолекулы функциональности вследствие химической модификации поверхности, пространственно затрудненные доступ к активным центрам или неправильной ориентации из-за неспецифического иммобилизации. Таким образом, все методы приводят к снижению чувствительности анализа, несмотря на увеличение осаждение биомолекул, ответ, вероятно, возникает из-за необходимости искусственно связывать биомолекул на поверхности.
Новый подход к производству функциональных биомолекулы микрочипов через штифт печати белка, легированногозоли диоксида кремния на твердые носители, которые обычно либо функционализированный предметные стекла или отдельные лунки пластинок микролуночные. Золь-гель процесс сам по себе происходит в водной среде при комнатной температуре, а это жидкий предшественник, который напечатан а затем гели для улавливания биомолекул в 3D-матрицы, что обеспечивает высокое содержание белка загрузки 13, а также улавливание нескольких компонентов в пределах и тот же элемент микрочипов. 13,14 пошива из полученных золь-гель материал может быть сделано путем тщательного подбора различных предшественников диоксида кремния, а также путем изменения водного компонента посредством использования различных буферов (рН, ионная сила), и включение различные добавки (полимеры, небольшие молекулы), чтобы достичь оптимального материала, специфический характер которого зависит от биомолекулы, захваченной 10.
Потенциальным ограничением, связанные с разработкой полученных золь-гель микрочипов белка через контакт-печатьнеобходимость выявления золь-гель на основе композиционных материалов, которые могут быть напечатаны без гелеобразующее в контактный или показ нежелательных свойств (невоспроизводимой размеров пятна, трещины, плохая адгезия, несовместимость с анализа компонентов, низкая активность белка) После печати на поверхности. 5 одновременных оптимизации всех этих параметров исключает материалов подход котором может быть выполнена заново, либо рассмотрены медленно в последовательной манере. С другой стороны, случайные скрининг многие тысячи или десятки тысяч материалов, ни времени, ни-рентабельным.
В этой статье мы опишем направлены скрининга подход, который позволяет быструю идентификацию подходящих материалов для производства белковых микрочипов без необходимости случайно скрининга большого количества материалов. Использование управляемых подход, материалы, пригодные для печати микрочипов, сначала идентифицируют с последующей серией мелких экранов, чтобы определить оптимальный полученных золь-гель материаловдр. комбинаций, которые могут быть напечатаны воспроизводимым, без трещин и совместимы с данным анализом. Наконец, оптимальные материалы идентифицированы на основе сохранения ферментативной активности и производительности в конечном малые молекулы скрининге. Таким образом, оптимальные материалы могут быть идентифицированы из многих тысяч кандидатов с использованием только несколько сотен шагов анализа. Покажем это подход к изготовлению и высокой плотности ацетилхолинэстеразы и мультикиназный микрочипов и использование таких микрочипов для малых молекул скрининга.
Методологии, описанной здесь был выбран как наиболее подходящий для идентификации печати полученных золь-гель материалов с контактом принтер, производя времени и экономически эффективного способа быстрого определения оптимальных материалов без необходимости скрининга большого количества материалов. Из общего числа ~ 20000 потенциальных материалов, можно было определить ~ 200 материалов, которые были пригодны для печати на основе гелеобразования время в одиночестве. Это значительно снизило количество материалов, необходимых для быть подготовлены для последующего испытания печати. Эти печатные материалы затем были напечатаны на 4 слайд поверхностей в общей сложности 768 материала ползуна. В среднем, 50 мест / повторов одного материала могут быть напечатаны в ~ 3 мин, в том числе загрузки образца месте осаждения и пин-код очистки. Из них 155 материалов, или примерно 20%, разрешено для печати максимальное количество пятен на решение поглощение и производится воспроизводимых размеров месте. Следует отметить, что из 4 слIDE поверхностей испытания, материалы печатных лучше в следующем порядке: амин> эпоксидной> альдегид> ПММА, PMMA слайды не производят полезные массивы для любых материалов. Это было вероятно, связано с полярностью покрытия. Сравнение вышеупомянутых поверхностей слайдов, более полярным амин и эпоксидной были лучше подходит для водных золей по сравнению с ПММА слайдов. Кроме того, испытанных поверхности, амин покрытием слайды обеспечить потенциал положительно заряженную поверхность для хранения анионный золь на связь. Мы подозреваем, наночастицы диоксида кремния на границе раздела между ползуном и золь взаимодействуют вдоль поверхности. Оба эпоксидных и поверхности альдегид слайд имеют те же начального заряда на основе взаимодействия. Для обеспечения оптимальной осаждения месте настоятельно рекомендуется использовать предварительно покрытых слайдов из поставщиков, таких как Arrayit. В доме-покрытие производит несовместимым поверхностей, которые приводят к плохой воспроизводимости месте 13, а в некоторых случаях может привести к количественной вероятностиблем. 18 Не менее важно, температуру и влажность влияют на "печатных" материалов. Пока никаких детальных исследований на эффекты, связанные с температурой не проводились, печать всегда проводить при комнатной температуре (23 ± 3 ° C). Влажность (более 80%) также регулировать в печатающую камеры для предотвращения осаждения нерегулярной формы из-за небольших объемов осаждения (0,7-2,3 нл) и испарения.
Хотя материал сито направляется к определению оптимального полученных золь-гель материалов, специально для печати АХЭ и киназы, небольшой набор материалов были идентифицированы, который работал на обоих типах белков. Действительно, и из материалов, которые были определены для изготовления биочипов киназы были основаны на SS + глицерин + ПВА, и оба материала также были определены в течение 26 материалов, выбранных для AChE микрочипов. Эти "оптимальный" материалы могут предложить общую отправную точку для дальнейшего развития PROTEв легированном золь-гель на основе микрочипов и небольших экранов вокруг этих композиций может идентифицировать еще лучше материалы для изготовления биочипов. Второй момент, который следует отметить, важность использованного фермента. В случае AChE (а надежные фермента), 26 (или около 40%) исходных материалов 66 определены как анализ совместимые сохранена активность захваченного AChE. Однако для более тонких киназы, только 2 из 69 анализа совместимой композиции, или примерно 3% от материалов, смогли сохранить активность всех киназ. В то время как достаточное количество различных ферментов не были изучены, чтобы сделать окончательный заявления, очевидно, что оптимизация изготовление массив с относительно нестабильными ферментов может привести к идентификации материалов, которые могут захватывать широкий спектр белков, чтобы позволить mutliplexed микрочипов изготовления.
Независимо от выбранного белка, основные отсечки фактор для идентификации печати материалов была необходимость в течение длительногоМатериал гелеобразования раза (> 2,5 ч). При разработке СС на основе золь-гель материалов, очень важно обеспечить, чтобы после ионного обмена и фильтрации золь при рН около 4. Золи с более низким начальным рН может привести к материалов с более низким, чем нейтральном рН, которые могут повлиять на активность фермента. 19 регулирования количества Dowex (ионообменная смола), чтобы SS может изменить конечный рН золя. Когда новый пакет смолу получают отношение смолы к SS должна быть отрегулирована таким образом, чтобы получить золи при рН около 4 процедуре, описанной в разделе 2 протокола.
Кроме того, получение кристаллической DGS часто является источником ошибки, связанной с материальными сбоя при использовании DGS золи на основе биомолекул для захвата. Хотя это и не представленные здесь подробно, большое внимание должно быть принято во время синтеза кристаллического АРД, в частности необходимость избежать присутствия воды в процессе синтеза, которые могут производить polyglycerated кремнеземTES, а не мономерные DGS. Кроме того, из-за гигроскопичности ДГУ, кристаллический образец необходимо хранить высушенный и использовать в течение 6 месяцев после синтеза. Кристаллический АРД старше 6 месяцев не могут растворяться полностью (вследствие частично конденсированного полиглицерина силикатного материала), даже при обработке ультразвуком в кислой среде. Неполном растворении DGS производит золу с неизвестным и неконтролируемым содержанием кремнезема и, таким образом, менее надежные материалы.
Важно отметить с контактной печати является качество контактов. Поврежденные или неправильно штифтов (рис. 9) никогда не будет производить воспроизводимых массивов зависит от материала печати. Рекомендуется проверить контактный качества с использованием рассечение микроскопом, чтобы обеспечить сломанной или забиты контакты не используются. Тщательная обработка обеспечивает длительный срок службы для контактов. Свободное передвижение контактный также важна. В случаях, когда влага удерживается в печатающую головку между головой и контактный, контактныйнельзя будет правильно и, следовательно, не будет делать надлежащий контакт с поверхностью, в результате чего отсутствие осаждения материала.
В заключение, мы предоставили подробную, многоступенчатый подход для разработки скрининга высокой плотности белка легированных пин-печатный микрочипов. Скрининг включает в себя оптимизацию свойств материала (время гелеобразования и печатные), чтобы печать материалов, с последующим более сосредоточены скрининга для идентификации материалов, которые совместимы с данным анализа и возможность сохранить ферментативную активность. Этот управляемый подход скрининга материал может быть нанесен на дополнительные форматы микрочипов сократить время и затраты, связанные с производством эффективный высокой плотности микрочипов.
The authors have nothing to disclose.
Авторы благодарят Марию Monton, Джули Lebert, Jessamyn Little, Xin Ge и Лаура Lautens за помощь в развитии белка микрочипов. Авторы также благодарят естественным наукам и инженерным исследованиям Совета Канады (NSERC) для финансирования этой работы. Авторы также благодарят Канада Фонд инноваций и Целевого Онтарио Инновации для поддержки этой работы. JDB заведует кафедрой исследований в Канаде Биоаналитическая химии и Biointerfaces.
Reagent/Material | |||
Poly(vinyl alcohol) (PVA) | Sigma-Alderich | 360627 | 80% hydrolozyed, Mw 600 |
Polyethylene glycol 600 (PEG) | Sigma-Alderich | 87333 | |
Polyethylenimine (PEI) | Sigma-Alderich | 482595 | 50% (w/w) solution in water |
Carboxyethylsilanetriol (Si-COOH) | Gelest, Inc. | SIC2263.0 | 25% in water |
N-(3-triethoxysilylpropyl) gluconamide(GLS) | Gelest, Inc. | SIT8189.0 | 50% in ethanol |
bis[(3-methyldimethoxysilyl)propyl]polypropylene oxide (MDSPPO) | Gelest, Inc. | SIB1660.0 | |
Methyltrimethoxysilane (MTMS) | Gelest, Inc. | SIM6560.1 | |
Bis(triethoxysiyly)ethane (Bis-TEOS) | Gelest, Inc. | SIB1817.0 | |
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES) | Gelest, Inc. | SIA0610.0 | |
Glycerol | Sigma-Alderich | 49767 | |
D-Sorbitol | Sigma-Alderich | 240850 | |
D-(+)-Trehalose dihydrate | Sigma-Alderich | T9531 | |
Triton X-100 | Sigma-Alderich | X-100 | |
Nε-Acetyl-L-lysine | Sigma-Alderich | A4021 | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane | Sigma-Alderich | 154563 | |
HEPES | Sigma-Alderich | H3375 | |
Sodium hydroxide, 1.0 N | LabChem Inc. | LC24350-2 | |
Hydrochloric Acid, 1.0 N/0.1 N | LabChem Inc. | LC15300-2/LC152220-2 | |
Magnesium chloride | Sigma-Alderich | M8266 | |
Diglycerolsilane (DGS) | Prepared in laboratory | ||
Sodium silicate solution | Fisher Scientific | SS338-1 | |
Dowex 50WX8-100 ion exchance resin | Sigma-Alderich | 217492 | |
Acetylthiocholine iodide | Sigma-Alderich | 1480 | |
Acetylcholinesterase from Electrophorus electricus (electric eel) | Sigma-Alderich | C2888 | |
BODIPY FL L-Cystine | Invitrogen | B-20340 | |
Pro-Q Diamond Phosphoprotein/Phosphopeptide Microarray Stain Kit | Invitrogen | P33706 | |
Adenosine 5'triphosphate disodium salt (ATP) solution | Sigma-Alderich | A6559 | |
MAP Kinase 2 (MAPK2) | EMD Millipore | 454850 | |
p38α/SAPK2a (T106M), active | EMD Millipore | 14-687M | |
Epidermal growth factor (EGFR) | EMD Millipore | Donated by Millipore | |
Glycogen synthase kinase 3β (GSK-3β) | EMD Millipore | 14-306 | |
Myelin basic protein (MBP) | EMD Millipore | Substrate for MAPK2 and p38α, Donated by Millipore | |
GSM | EMD Millipore | 12-533 | Substrate for GSK-3β |
Poly-glu-tyr polypeptide p(E4Y) | EMD Millipore | 12-440 | Substrate for EGFR |
Stealth pin | ArrayIt | SMP3 | |
Stealth pin | ArrayIt | SMP7 | |
Amine coated slides | ArrayIt | SMM2 | |
Aldehyde coated slides | ArrayIt | SMA2 | |
Exposy coated slides | ArrayIt | SME2 | |
Poly(methylmethacrylate) (PMMA) coated slides | Exakt Technologies Inc. | 41500 | |
0.2-μm syringe filter | PALL Life Sciences | 4612 | |
Equipment | |||
Virtek Contact Printer | BioRad | ||
Novaray Fluorescence Slide Imager | Alpha Innotech Corporation | ||
Desktop microarray centrifuge | ArrayIt | MHC110V | |
MilliQ Synthesis A10 | Millipore | Used to filter all water required for experiments |