Tek molekül Protein Araştırmaları Yüzey Pasifleme
Summary
Biz, polietilen glikol (PEG) kullanılarak bir cam yüzey pasifleştirilmesi için bir yöntem tarif eder. Bu protokol yüzey temizleme, yüzey işlevselleştirilmesini ve PEG kaplama kapsar. Biz, mevcut yöntemlere kıyasla, pasivasyon üstün kalite sağlar ki, iki tur boyunca PEG molekülleri ile yüzeyin muamele edilmesi için yeni bir strateji tanıtmak.
Abstract
Tek molekül floresan spektroskopisi nano biyolojik olayların geniş bir anlayış vesile olduğu kanıtlanmıştır. Bu teknik, biyolojik bilimlerin verebilir ne önemli örnekleri protein-protein ve protein-nükleik asit etkileşimleri üzerinde mekanik anlayışlar vardır. Protein etkileşimleri, tek molekül düzeyinde problandı zaman, proteinler ya da alt-tabakalar, genellikle uzun süreli bir gözlem için izin veren bir cam yüzey üzerinde immobilize edilir. Bu immobilizasyon şeması istenmeyen yüzey eserleri tanıtmak olabilir. Bu nedenle, bu atıl hale getirmek için cam yüzeyi etkisizleştirmek için gereklidir. Polietilen glikol (PEG) ile yüzey kaplama spesifik olmayan bir cam yüzey ile etkileşim proteinleri önlenmesinde yüksek performans için öne çıkmaktadır. Bununla birlikte, polimer kaplama prosedürü nedeniyle yüzey için gereken yüzey işlemleri, bir dizi ve sıkı zorunluluğundan kaynaklanan komplikasyon için, zordurProsedürün sonunda herhangi bir flüoresan molekül arındırılmış olması. Burada, biz adım adım talimatları ile sağlam bir protokol sağlar. Bu pirana aşındırma, amin gruplarıyla yüzey işlevsellik ve son olarak PEG kaplama dahil olmak üzere bir yüzey temizleme kapsar. PEG tabakanın bir yüksek yoğunluk elde etmek için, oldukça pasivasyon kalitesini artırır iki tur boyunca PEG molekülleri ile yüzeyin muamele edilmesi için yeni bir strateji tanıtmak. Herkes yüksek kaliteli yüzey pasivasyon elde edebilirsiniz, böylece temsili sonuçlar yanı sıra her bir kritik aşama için pratik önerilerde bulunur.
Introduction
Tek moleküllü protein çalışma yaparken bu deney, herhangi bir yüzey kaynaklı protein arıza veya denaturasyon 1,2 arınmış, böylece yüzey pasivasyon yüksek bir kalite elde etmek için gereklidir. , Sığır serum albümin gibi yüzey aktif maddeler, ile muamele edilmiş, bir cam yüzey, genel olarak, tek bir nükleik asit molekülü çalışmalar 3 için kullanılır iken, bu pasivasyon derecesi protein çalışmaları için yeterince yüksek değildir. Polimer (polietilen glikol, PEG) ile kaplanmış bir cam yüzeyi pasifleştirme performans 4-6 üstündür. Böylece, o bir tek-molekül floresan çalışmada 7-10 tanıtıldı beri tek-molekül protein çalışmaları için evrensel kullanılır hale gelmiştir. Polimer kaplama prosedürü birden fazla yüzey işlemleri 7,11,12 gerektirir. Bu nedenle, ayrıntılı talimatlar olmadan tüm prosedürü takip etmek zordur. Genellikle yüzey pasivasyon derecesi protokol i bağlı olarak değişirs izledi. İşte biz tek-molekül protein çalışmaların önemli darboğazları birini kaldıracak adım-adım talimatlar ile sağlam bir protokol mevcut. Genel bakış için Şekil 1'e bakınız.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol kapsamında kritik adım
Bu amino-silanizasyon reaksiyondan önce yüzeyi hidrofilik hale getirmek için gereklidir. Bu, cam / kuvars yüzeyi üzerindeki serbest hidroksil grubu oluşturur pirana aşındırma yoluyla elde edildi. Yavaş yavaş iner yüzeyin hidrofil bu yana uzun bir süre için 2 H, O ya da hava ya da maruz kalan pirana kazınmış yüzey tutmak için önerilir.
NHS-ester PEG molekülü reaktiftir. -20 º C'de numuneler oluşturun ve azot altında bunları saklamak için tavsiye edilir Oda sıcaklığında APTES kimyasal raf ömrü kısa. Her ay bir yenisi ile değiştirmeniz tavsiye edilir.
Bu protokolün Değişiklikler
Eğer herhangi bir pratik bir nedenle piranha aşındırma kullanamazsınız zaman, zaman uzun bir süre için KOH kullanılarak aşındırma (örneğin oyeterli olmasını) e sahip ve hidroksil grubu da maruz yapacaktır. Bu alternatif yaklaşımın sıkan slayt ciddi çizikler nedeniyle birkaç geri dönüştürür sonra kullanılamaz hale geliyor.
Bu genellikle floresan organik malzemeler 7 giderilmesinde etkilidir propan meşale kullanarak bir cam / kuvars yüzey yakmak için uygulanmaktadır. Bu piranha gravür yedekli olduğundan bu işlem bu protokolde yer değildi. Bu işlem potansiyel olarak hidroksil gruplarının oksidasyonu yol unutmayın. Bir yüzey ya da KOH pirana çözeltisi kullanılarak kabartma bir kez Bu nedenle, bu işlem gerçekleştirilebilir olmamalıdır.
7 'den daha düşük pH değerine sahip bir tampon tek molekül görüntüleme için kullanıldığı zaman, PEG konformasyon pasivasyon derecesini azaltır "fırça" için "mantar" değişir. 7.0 'dan daha düşük pH kullanıldığı zaman, bu nedenle, daha da disukinimidil tartarat <kullanarak yüzeyi etkisizleştirmek için önerilirsup> 7.
Perspektifler
Bu çalışma, yüksek kaliteli yüzey pasivasyon ulaşmak için sağlam bir protokol sağlamıştır. Bu protokol, protein 14 hem de hücre ekstreleri içinde protein kompleksleri ile ilgili ve 15 imüno olan tek molekül floresan çalışmaları için yararlı olacaktır. Bu, yaygın olarak kuvvet ve tork spektroskopisi spektroskopisi 16 gibi diğer tek molekül teknikleri kullanılacaktır. Ayrıca, bir yüzey 17 adsorbe hücreleri önlemek için yararlı olacaktır.
Bu çalışmada verilen protokol, çok adımlı işlemler için talep edilir. Lipid-PEG 8 ve poli-lisin PEG 9 ile yüzey pasivasyon alternatif bir yaklaşım olarak kullanılabilir. Bu yana, bunu uygulamak kolay olan herhangi bir kimyasal reaksiyonlar gerektirmez. Ancak, pasivasyon derecesi kimyasal modif yoluyla elde bu kadar yüksek değilBir yüzeyin ication.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
SDC, ACH ve CJ Avrupa Araştırma Konseyi aracılığıyla Hibeler (ERC-StG-2012-309509) Başlangıç tarafından desteklenmiştir. J.-MN Kore Ulusal Araştırma Vakfı (UÇK) (2011-0018198) tarafından desteklenen; ve Kore ÇKS sayesinde Pioneer Araştırma Merkezi Programı (2012-009586) Bilim, ICT Bakanlığı ve Gelecek Planlaması (MSIP) tarafından finanse edilmektedir. Bu çalışma aynı zamanda Küresel Frontier Projesi (H-GUARD_2013-M3A6B2078947) gibi Kore MSIP tarafından finanse BiyoNanoTeknoloji Sağlık-Guard Merkezi tarafından desteklenmiştir. YKL ve J.-HH Seul City, Kore Seul Bilim Burs Programı tarafından desteklenmiştir. Etiketli Rep proteini Dr Şua Myong cömert bir hediye oldu.
Materials
| 1. Slide preparation and cleaning | |||
| Acetone | Sigma | 32201 | 1 L |
| Coverslips | VWR | 631-0136 631-0144 631-0147 | 24x32mm2, 22x40mm2, 24x50mm2 (No.1½, Rectangular) |
| Diamond drill bits | MTN-Giethoorn, The Netherlands | LA-0564-00DB | 3/4 mm |
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| Glass staining dishes | Fisher Scientific | 300101 | |
| H2O2 | Boom | 6233905 | Opened bottles should be stored at 4 °C. 1 L, hydrogen peroxide 30% |
| H2SO4 | Boom | 80900627.9010 | Sulfuric acid 95-98% |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| Quartz slides | Finkenbeiner | 1” x 3”, 1 mm thick | |
| 2. Coverslip cleaning | |||
| Duran slide holder | LGS, The Netherlands | 213170003 | |
| KOH | Sigma | 30603 | Potassium hydroxide |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 3. Amino-silanization of slides and coverslips | |||
| Acetic acid | Sigma | 320099-500ML | Acetic acid, glacial |
| APTES | Sigma-Aldrich | 281778-100ML | Store at the room temperature under N2 . Replace once in a month. 3-aminopropyl trimethoxysilane |
| Flask (200mL) | VWR | Flask (200 mL) | Have one flask dedicated for aminosilanization. Pyrex flask |
| Methanol | Sigma | 32213 | 1 L |
| Sonicator | Branson | Tabletop ultrasonic cleaner, 3510 | |
| 4. Surface passivation using polymer (the first round) | |||
| Biotin-mPEG | Laysan Bio | Biotin-PEG-SVA-5000-100mg | Store aliquots of 1-2 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. Biotin-PEG-SVA, MW 5,000 Da |
| mPEG | Laysan Bio | MPEG-SVA-5000-1g | Store aliquots of 80 mg (enough for 10 slides) at -20 °C under N2. mPEG-succinimidyl valerate (SVA), MW 5,000 Da |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 6. Surface passivation (the second round) | |||
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Dimethyl sulfoxide BioReagent, for molecular biology, ≥99.9% |
| DST | Pierce | 20589 | Disuccinimidyl tartarate |
| MS4-PEG | Pierce | 22341 | Dissolve 100 mg MS4-PEG in 1.1 mL DMSO. Store 20 mL aliquots at -20 °C. Short NHS-ester PEG, MW 333 Da |
| Sodium bicarbonate | Sigma | S6014-500G | |
| 7. Assembling a microfluidic chamber | |||
| Double sticky tape | Scotch | 10mm wide | |
| Epoxy | Thorlabs | G14250 | Devcon 5 minute epoxy |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S9888-1 KG | Sodium chloride |
| Neutravidin | Pierce | 31000 | Stock in 5 mg/mL in H2O at 4 °C. ImmunoPure NeutrAvidin Biotin-Binding protein |
| Streptavidin | Invitrogen | S-888 | Stock 5 mg/mL in H2O or T50 at 4 °C. |
| Trizma base | Sigma-Aldrich | T1503-1 KG | Tris |
References
- Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. Surfaces and orientations: much to FRET about. Acc Chem Res. 38 (7), 542-548 (2005).
- Lamichhane, R., Solem, A., Black, W., Rueda, D. Single-molecule FRET of protein-nucleic acid and protein-protein complexes: surface passivation and immobilization. Methods. 52 (2), 192-200 (2010).
- Di Fiori, N., Meller, A. Automated system for single molecule fluorescence measurements of surface-immobilized biomolecules. J Vis Exp. (33), 1542-1510 (2009).
- Kingshott, P., Griesser, H. J. Surface that resist biodegradation. Curr Opin Solid St M. 4 (4), 403-412 (1999).
- Elbert, D. L., Hubbell, J. A. Surface treatments of polymers for biocompatibility. Annu Rev Mater Sci. 26, 365-394 (1996).
- Zalipsky, S., Preface Harris, J. M. . Poly(theylene glycol). , 11-12 (1997).
- Selvin, P. R., Ha, T. . Single-Molecule Techniques: A Laboratory Manual. , (2007).
- Finkelstein, I. J., Greene, E. C. Supported lipid bilayers and DNA curtains for high-throughput single-molecule studies. Methods Mol Biol. 745, 447-461 (2011).
- Kenausis, G. L., et al. Poly(L-lysine)-g-Poly(ethylene glycol) layers on metal oxide surfaces: attachment mechanism and effects of polymer architecture on resistance to protein adsorption. J Phys Chem B. 104 (14), 3298-3309 (2000).
- Groll, J., Star Moeller, M. polymer surface passivation for single-molecule detection. Method Enzymol. 472, 1-18 (2010).
- Bahmani, B., Gupta, S., Upadhyayula, S., Vullev, V. I., Anvari, B. Effect of polyethylene glycol coatings of uptake of indocyanine green loaded nanocapsules by human spleen macrophages in vitro. J Biomed Opt. 16 (5), (2011).
- Kulczyk, A. W., Tanner, N. A., Loparo, J. J., Richardson, C. C., van Oijen, A. M. Direct observation of enzymes replicating DNA using a single-molecule DNA stretching assay. J Vis Exp. (37), e1689 (2010).
- Upadhyayula, S., et al. Coatings of polyethylene glycol for suppressing adhesion between solid microspheres and flat surfaces. Langmuir. 28 (11), 5059-5069 (2012).
- Dulin, D., Lipfert, J., Moolman, M. C., Dekker, N. H. Studying genomic processes at the single-molecule level: introducing the tools and applications. Nat Rev Genet. 14, 9-22 (2012).
- Joo, C., Fareh, M., Narry Kim, V. Bringing single-molecule spectroscopy to macromolecular protein complexes. Trends Biochem Sci. 38 (1), 30-37 (2012).
- Neuman, K. C., Nagy, A. Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy. Nat Methods. 5, 491-505 (2008).
- Lee, H., Dellatore, S. M., Miller, W. M., Messersmith, P. B. Mussel-inspired surface chemistry for multifunctional coatings. Science. 318, 426-430 (2007).
