Growth La medición y de la Expresión Génica Dinámica de Tumor-Targeted<em> S. Typhimurium</em> Las bacterias
Summary
La meta de estos experimentos es para generar datos de tiempo-por supuesto cuantitativas a la la el crecimiento y el dinámica de la expresión de genes de atenuada<em> S. typhimurium</em> Colonias de bacterias que crecen dentro de tumores. Este video cubre la preparación tumor de células de y el implante de, la preparación bacteria y la inyección, proyección de imagen su conjunto-animal de luminiscencia, la excisión tumor, y el conteo de colonia bacteriana.
Abstract
La meta de estos experimentos es para generar datos de tiempo-por supuesto cuantitativas a la la el crecimiento y el dinámica de la expresión de genes de atenuada S. typhimurium colonias bacterianas que crecen dentro de los tumores.
Hemos generado los tumores de xenoinjerto modelo en ratones mediante inyección subcutánea de una línea celular de cáncer de ovario humana, OVCAR-8 (NCI Repositorio de Tumor DCTD, Frederick, MD).
Se transformaron cepas atenuadas de S. bacterias typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) con una luciferasa expresada constitutivamente (luxCDABE) plásmido para la visualización 2. Estas cepas colonizan específicamente los tumores mientras que restante esencialmente no-virulenta a la del ratón 1.
Una vez que se establecieron los tumores medibles, las bacterias fueron inyectados por vía intravenosa a través de la vena de la cola con diferentes dosis. Del Tumor-localizada, la expresión de genes bacteriana se monitorizó en el tiempo real a través de el curso de 60 horas utilizando unen sistema de imágenes in vivo (de IVIS). En cada punto de tiempo, los tumores se extirparon, se homogeneizó, y se sembraron para cuantificar las colonias bacterianas para la correlación con datos de expresión génica.
Juntos, este de datos rinde un medida cuantitativa de la en crecimiento in vivo y dinámica de la expresión de genes de las bacterias que crecen dentro de los tumores.
Introduction
La biología sintética ha progresado rápidamente en la última década y ahora está posicionada para impactar los problemas importantes de la energía y la salud. Sin embargo, expansión en el arena clínica ha sido ralentizado por las preocupaciones de seguridad y una ausencia de el desarrollo de criterios de diseño para en los circuitos de genéticos in vivo. Acelerar las aplicaciones médicas de alto impacto requerirá métodos que interactúan directamente con la infraestructura médica, circuitos genéticos que funcionan fuera del entorno de laboratorio controlado, y los huéspedes microbianos seguros y clínicamente aceptado utilizar.
Un número de cepas han sido investigado para la terapia de cáncer de debido a la su capacidad para crecer preferencialmente en los tumores de. Estos han incluido C. novyi, E. coli, V. cholorae, B. longum, y la S. typhimurium 3-8. S. typhimurium ha generado particular, interés, ya que han exhibido la seguridad y la tolerancia en un número de los ensayos clínicos humanos 9-12. Estos bacteri un fueron mostrados inicialmente para crear efectos anti-tumorales a través de la estimulación de la sistema de inmune del huésped y por el agotamiento de nutrientes requeridos para el metabolismo de celular de cáncer de. De Producción de de carga terapéutica más tarde se añadió a través de modificaciones genéticos. Mientras que estos estudios representan importantes avances en el uso de las bacterias para las terapias de tumorales, la mayoría de los esfuerzos de existentes se han basado en de alta-nivel de expresión que típicamente da como resultado en la entrega de de alta dosificaciones, efectos de fuera de objetivo, y de desarrollo de la resistencia del huésped 13-16 de .
Ahora, la biología sintético puede añadir producción de de carga programable de mediante la utilización de circuitos de genéticos computacionalmente-diseñados que pueden realizar sensing y la entrega 17-20 avanzados. Estos circuitos de pueden ser diseñados para actuar como los sistemas de de entrega que detectan estímulos del tumor-específicas y de la libre-regular la de producción de carga como sea necesario. Sin embargo, el estudio de la función de estos circuitos en vivo hasta el momento ha sido difícil.
ve_content "> Dado que plásmidos son la marco común para los circuitos de sintéticos, nos describimos un método para caracterizar la dinámica de la la expresión de genes plásmido-basado en en in vivo el uso de un modelo de ratón. Estos métodos utilizan proyección de imagen luminiscencia de lapso de tiempo y la medición cuantitativa de la biodistribución. Juntos, estos enfoques proporcionan un marco para el estudio de redes de plásmido-basados en in vivo para las aplicaciones clínicas.Protocol
Representative Results
Discussion
El uso de este procedimiento, que son capaces de generar cursos a tiempo para el crecimiento y la dinámica de la expresión de genes de bacterias que colonizan los tumores. Si bien estas mediciones se realizan rutinariamente in vitro en cultivo discontinuo o dispositivos de microfluidos, que son mucho más difíciles de realizar in vivo.
Hay varias modificaciones que se pueden aplicar a estos métodos. Mientras que se utilizó la línea celular OVCAR-8 para generar nuestro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Damos las gracias a H. Fleming para la lectura crítica y la edición del manuscrito. Este trabajo fue apoyado por una beca postdoctoral Misrock (TD) y NDSEG de Becas de Postgrado (AP). SNB es un investigador del HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
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