צמיחת מדידה וDynamics ביטוי גנים של גידול ממוקד<em> ס Typhimurium</em> חיידקים
Summary
המטרה של ניסויים אלה היא להפיק נתונים בזמן קורס כמותיות על הצמיחה והדינמיקה של ביטוי גנים נחלשו<em> ס typhimurium</em> מושבות חיידקים הגדלים בתוך גידולים. סרטון זה עוסק בהכנת גידול תא והשתלה, הכנת חיידקים והזרקה, הדמיה כל בעלי החיים הארה, כריתת גידול, וספירת חיידקי מושבה.
Abstract
המטרה של ניסויים אלה היא להפיק נתונים בזמן קורס כמותיות על הצמיחה והדינמיקה של ביטוי גנים נחלשו ס מושבות חיידקי Typhimurium גדלו בתוך גידולים.
אנחנו שנוצרנו גידולי xenograft מודל בעכברים על ידי הזרקה תת עורית של שורת תאי סרטן השחלות אנושית, OVCAR-8 (מאגר גידול DCTD NCI, פרדריק, MD).
אנחנו הפכנו זנים מוחלשים של ס ' חיידקי typhimurium (ELH430: SL1344 phoPQ-1) עם לוציפראז constitutively הביע (luxCDABE) פלסמיד להדמיה 2. זנים אלה במיוחד ליישב גידולים תוך שמירה על המהות שאינה ארסית לעכבר 1.
ברגע שגידולים מדידים הוקמו, החיידקים הוזרקו דרך הווריד דרך וריד הזנב עם משתנה מינון. גידולים מקומיים, ביטוי חיידקי גן היה פיקוח בזמן אמת במהלך 60 שעות באמצעותin vivo הדמיה המערכת (IVIS). בכל נקודת זמן, גידולים שנכרתו, הומוגני, ומצופים לכמת מושבות חיידקים למתאם עם נתוני ביטוי גנים.
יחד, נתונים זה מניב מדד כמותי לצמיחה בvivo ודינמיקת ביטוי גנים של חיידקים הגדלים בתוך גידולים.
Introduction
ביולוגיה סינטטי התקדמה במהירות בעשור האחרון, וכעת נמצאת בעמדה כדי להשפיע על בעיות חשובות בתחום אנרגיה ובריאות. עם זאת, התרחבות לזירה הקלינית הואטה על ידי חששות בטיחות והיעדר פיתוח קריטריונים לעיצוב במעגלים גנטיים vivo. האצת יישומים רפואי השפעה גבוהה תדרוש שימוש בשיטות שממשק ישיר עם תשתית רפואית, מעגלים גנטיים שפועלים מחוץ לסביבת המעבדה המבוקרת, ומארחי חיידקים בטוחים וקלינית מקובלים.
מספר הזנים נחקר לטיפול בסרטן בשל היכולת שלהם לגדול באופן מועדף בגידולים. אלה כללו ג נובי, E. coli, ו 'cholorae, longum ב', וס typhimurium 3-8. ס typhimurium יצר עניין מסוים כפי שהם הציגו בטיחות וסובלנות במספר הניסויים קליניים בבני אדם 9-12. bacteri אלה הוצגו בתחילה כדי ליצור אפקטים אנטי סרטניים באמצעות גירוי של מערכת החיסון על ידי המארח ודלדול של חומרים מזינים הנדרשים לחילוף חומרים של תאי סרטן. ייצור של מטענים הטיפוליים מאוחר יותר נוסף בעקבות שינויים גנטיים. בעוד שמחקרים אלה מייצגים התקדמות חשובות בשימוש בחיידקים לטיפולים סרטניים, רוב המאמצים קיימים יש לסמוך על ביטוי ברמה גבוהה, שנובע בדרך כלל במשלוח של מינונים גבוהים, אפקטים מחוץ היעד, והתפתחות של עמידות מארח 13-16 .
עכשיו, ביולוגיה סינטטי עשויה להוסיף ייצור מטענים לתכנות על ידי ניצול מעגלים גנטיים המחשוב מעוצב שיכול לבצע חישה ומשלוח 17-20 מתקדמות. יכולים להיות מתוכננים מעגלים אלה לפעול כמערכות שיגור שחשים גירויים ספציפיים לגידול וייצור מטענים עצמי לווסת לפי צורך. עם זאת, לומד את הפונקציה של מעגלים אלה in vivo עד כה היה מאתגר.
> Ve_content "מאז פלסמידים הם המסגרת המשותפת למעגלים סינטטיים, אנו מתארים שיטה כדי לאפיין את הדינמיקה של ביטוי גנים המבוסס על פלסמיד in vivo תוך שימוש במודל עכבר. שיטות אלה לנצל הדמיה הארה זמן לשגות ומדידת כמותית של biodistribution. יחד, גישות אלה מספקות מסגרת ללימוד רשתות מבוססות פלסמיד in vivo עבור יישומים קליניים.Protocol
Representative Results
Discussion
באמצעות הליך זה, אנו מסוגלים לייצר קורסי זמן לצמיחה ודינמיקת ביטוי גנים של חיידקים מיישבים גידולים. בעוד מדידות אלה מבוצעות באופן שגרתי במבחנה בתרבות אצווה או מכשירים מיקרופלואידיקה, הם הרבה יותר קשים לבצע בגוף חי.
ישנ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לח' פלמינג לקריאה ביקורתית ועריכה של כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי מלגת Misrock דוקטורים (TD) וNDSEG בוגרת מלגה (AP). בנק המרכזי של שוויץ הוא חוקר HHMI.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 ml syringe | BD Biosciences | 309602 | |
| 3/10 cc Insulin Syringe | BD Biosciences | 309301 | |
| PrecisionGlide Needle | BD Biosciences | 301629 | |
| RPMI Medium 1640 (1X), liquid, with L-glutamine | Invitrogen | 11875-119 | |
| Ampicillin | Sigma Aldrich | A0166-5G | |
| LB Agar Broth | Sigma Aldrich | L2897 | |
| Luria-Bertani broth | BD Biosciences | 244610 |
References
- Hohmann, E. L., Oletta, C. A., Miller, S. I. Evaluation of a phoP/phoQ-deleted, aroA-deleted live oral Salmonella typhi vaccine strain in human volunteers. Vaccine. 14 (1), 19-24 (1996).
- Leschner, S., et al. Tumor Invasion of Salmonella enterica Serovar Typhimurium Is Accompanied by Strong Hemorrhage Promoted by TNF-alpha. Plos One. 4 (8), (2009).
- Min, J. J., et al. Quantitative bioluminescence imaging of tumor-targeting bacteria in living animals. Nat. Protoc. 3 (4), 629-636 (2008).
- Min, J. J., et al. Noninvasive real-time imaging of tumors and metastases using tumor-targeting light-emitting Escherichia coli. Mol. Imaging Biol. 10 (1), 54-61 (2008).
- Choy, G., et al. Comparison of noninvasive fluorescent and bioluminescent small animal optical imaging. Biotechniques. 35 (5), 1022-1033 (2003).
- Pawelek, J. M., Low, K. B., Bermudes, D. Tumor-targeted Salmonella as a novel anticancer vector. Cancer Research. 57 (20), 4537-4544 (1997).
- Fu, X., Hoffman, R. M. Human ovarian carcinoma metastatic models constructed in nude mice by orthotopic transplantation of histologically-intact patient specimens. Anticancer Res. 13 (2), 283-286 (1993).
- Ozbudak, E. M., et al. Regulation of noise in the expression of a single gene. Nat. Genet. 31 (1), 69-73 (2002).
- Elowitz, M. B., et al. Stochastic gene expression in a single cell. Science. 297 (5584), 1183-1186 (2002).
- Toso, J. F., et al. Phase I study of the intravenous administration of attenuated Salmonella typhimurium to patients with metastatic melanoma. J. Clin. Oncol. 20 (1), 142-152 (2002).
- Heimann, D. M., Rosenberg, S. A. Continuous intravenous administration of live genetically modified salmonella typhimurium in patients with metastatic melanoma. J. Immunother. 26 (2), 179-180 (2003).
- Forbes, N. S. Engineering the perfect (bacterial) cancer therapy. Nat. Rev. Cancer. 10 (11), 785-794 (2010).
- Guo, H., et al. Targeting tumor gene by shRNA-expressing Salmonella-mediated RNAi. Gene Ther. 18 (1), 95-105 (2011).
- Hoffman, R. M. Tumor-seeking Salmonella amino acid auxotrophs. Curr Opin Biotechnol. 22 (6), 917-923 (2011).
- Nguyen, V. H., et al. Genetically engineered Salmonella typhimurium as an imageable therapeutic probe for cancer. Cancer Research. 70 (1), 18-23 (2010).
- Zhao, M., et al. Targeted therapy with a Salmonella typhimurium leucine-arginine auxotroph cures orthotopic human breast tumors in nude mice. Cancer Research. 66 (15), 7647-7652 (2006).
- Danino, T., et al. A synchronized quorum of genetic clocks. Nature. 463 (7279), 326-330 (2010).
- Anderson, J. C., et al. Environmentally controlled invasion of cancer cells by engineered bacteria. J. Mol. Biol. 355 (4), 619-627 (2006).
- Hasty, J., McMillen, D., Collins, J. J. Engineered gene circuits. Nature. 420 (6912), 224-230 (2002).
- Prindle, A., et al. A sensing array of radically coupled genetic ‘biopixels’. Nature. 481 (7379), 39-44 (2012).
- Xu, D. Q., et al. Bacterial delivery of siRNAs: a new approach to solid tumor therapy. Methods Mol. Biol. 487, 161-187 (2009).
- Zheng, L. M., et al. Tumor amplified protein expression therapy: Salmonella as a tumor-selective protein delivery vector. Oncol. Res. 12 (3), 127-1235 (2000).
- Kim, K., et al. A novel balanced-lethal host-vector system based on glmS. Plos One. 8 (3), e60511 (2013).
- Prindle, A., et al. Genetic Circuits in Salmonella typhimurium. ACS Synthetic Biology. , (2012).
- Danino, T., et al. In vivo gene expression dynamics of tumor-targeted bacteria. ACS Synthetic Biology. , (2012).
- Zhao, M., et al. Spatial-temporal imaging of bacterial infection and antibiotic response in intact animals. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (17), 9814-9818 (2001).
