Trypsine Digest Protocol bij het netvlies Vasculature van een muismodel Analyseer
Summary
Trypsine digest is een van de meest gebruikte methoden voor retinale vasculatuur analyseren. Dit manuscript beschrijft de methode in detail, met inbegrip van belangrijke wijzigingen aan de techniek te optimaliseren en te verwijderen van de niet-vaatweefsel met behoud van de algehele architectuur van de schepen.
Abstract
Trypsine digest is de gouden standaard methode voor het analyseren van de retinale vaatstelsel 1-5. Het maakt visualisatie van het gehele netwerk van complexe driedimensionale retinale bloedvaten en haarvaten door een tweedimensionale platte bevestiging van de verbonden vasculaire kanalen na digestie van de niet-vasculaire componenten van de retina. Hierdoor kan men verschillende pathologische vasculaire veranderingen, zoals microaneurysms, capillaire degeneratie en abnormale endotheliale te pericyte verhoudingen bestuderen. De methode is technisch moeilijk, vooral muizen, die de meest beschikbare diermodel om retina studie vanwege het gemak van genetische manipulaties 6,7 geworden. In de muis oog, is het bijzonder moeilijk de niet-vasculaire componenten volledig verwijderen terwijl de algehele architectuur van de retinale bloedvaten. Tot op heden is er een gebrek aan literatuur die de trypsine digest techniek beschrijft in detail in de muis. Dit manuscript bevat een gedetailleerde stap-voor-stap methode van de trypsine digest in muisretina, terwijl het ook tips over het oplossen van problemen moeilijke stappen.
Introduction
Visualiseren van de vasculatuur van het netvlies is een zeer belangrijke aanpak de mechanismen van verschillende oogziekten zoals diabetische retinopathie ontleden. Het maakt het mogelijk om de vroegste vasculaire afwijkingen, waaronder microaneurysms, capillaire degeneratie, en pericyte verlies 8,9 beoordelen. Tot op heden zijn er diverse technieken ontwikkeld om de retinale vasculatuur analyseren geweest. Perfusie van verschillende kleurstoffen is gebruikt om de schepen te markeren, maar ze hebben allemaal dezelfde beperkingen als gedeeld. Injectie zelden benadrukt het gehele retinale vasculatuur indien gegeven bij een hoge druk, welke risico scheuren en beschadiging van de vaten 1. Immunokleuring van vasculaire endotheel met fluorofoor-gelabelde G isolectin B4 (Alexa Fluor 594 geconjugeerd; I21413, Invitrogen, 1:100 verdunning) en retinale platte mounts kan de algemene architectuur van de schepen te markeren, maar zonder gedetailleerde visualisatie van haarvaten, basaalmembranen en pericytes . Het werd opgemerkt doorFriedenwald dat schepen door kleuring flatscreen-mounts van het netvlies met periodieke zuur-Schiff (PAS) of hematoxyline en eosine (H & E) kleuring 10 kan worden gemarkeerd. Echter, kleuring was niet specifiek voor de vaartuigen en wezen niet-vasculaire weefsels alsmede, waardoor het moeilijk om de schepen differentiëren. In de jaren 1960, en Cogan Kuwabara ontwikkelde de trypsine digestie techniek die het gemakkelijker gemaakt om de retinale vasculatuur visualiseren digereren de vasculaire componenten van de retina 1. Sinds die tijd heeft het trypsine digest uitgegroeid tot de gouden standaard methode in het analyseren van het vaatstelsel van het netvlies 2-5. Het is echter belangrijk op te merken dat andere alternatieve technieken voor de vasculatuur isoleren zijn beschreven. Het gebruik van osmotische lysis is gebruikt om de vasculatuur te isoleren en laat biochemische studies van het weefsel 11,12, maar de procedure niet is gebruikt als een primaire methode voor anatomische studie. Het weefsel print-methode is geweestgebruikt om grote segmenten van capillairen isoleren en laat de mogelijkheid om de elektrotone architectuur van de vasculatuur 13 bestuderen. In theorie zou deze techniek ook gebruikt worden om anatomische veranderingen te bestuderen, aangezien de kwaliteit van de vaten hoog. Het is echter alleen in staat om delen van het gehele vaatstelsel netwerk isoleren. Hoewel deze methoden niet kan vervangen trypsine verteren, is het belangrijk op te merken dat ze verschillende voordelen en tekortkomingen en zijn complementair in dit verband.
De trypsine digest methode is technisch uitdagend en moeilijk om consequent 6,7 voeren. Voorts is geconstateerd dat trypsine digestie bijzonder moeilijk een muismodel, vooral wanneer men wenst de algemene vasculaire architectuur van de retina 6,7 bewaren. Uitdagingen omvatten (1) over-digestie van het netvlies dat het verlies van zowel de vasculatuur en niet-vasculair weefsel veroorzaakt, (2) onder-digestie, waarbijuitgebreide mechanische dissectie hetgeen weer leiden tot beschadiging van het membraan bed, (3) slechte scheiding van de niet-vasculair weefsel van het vaatstelsel leidt tot niet-specifieke kleuring. Verschillende handschriften hebben gewezen op deze uitdagingen, maar niemand heeft een gedetailleerde en consistente protocol om ze te overwinnen 14,15. Dit manuscript zal een stap-voor-stap methode waarin de techniek om de trypsine digest uitvoeren op muizen en ratten netvliezen met concrete tips over het omgaan met de bijzonder moeilijke stappen te introduceren. Een schematisch overzicht in figuur 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trypsine digest is een standaardmethode om de vasculatuur van het netvlies te beoordelen. Helaas, het is technisch uitdagend en kan leiden tot een hoge mate van specimen verlies indien niet correct uitgevoerd. Verder is de bijzonder moeilijk in muizen, waarin de toepassing van deze techniek in het algemeen gebruikte genetische diermodellen van oogziekten kunnen beperken. Dit document geeft richtlijnen over hoe de procedure doeltreffend en consequent uit te voeren in de muis ogen.
Er zijn een…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd gedeeltelijk ondersteund door de NIH RO1-EY019951 (AAF), Illinois Vereniging voor Preventie van Blindheid (JCC, AAF), onbeperkte middelen om de afdeling Oogheelkunde van het Onderzoek om Blindheid (RPB) voorkomen, NY en RPB Medical Student Fellowship Grant (JCC).
Materials
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 |
References
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
- Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
- Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
- Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
- Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
- Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
- . Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , (2005).
- Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. , (2008).
- Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
- Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
- Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
