التربسين بروتوكول دايجست لتحليل الأوعية الدموية الشبكية للنموذج الفأر
Summary
التربسين هضم هي واحدة من الطرق الأكثر استخداما لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. يصف هذا المخطوط الأسلوب في التفاصيل، بما في ذلك التعديلات الرئيسية لتحسين تقنية وإزالة الأنسجة غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للسفن.
Abstract
التربسين هضم هو الأسلوب معيار الذهب لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين 1-5. فإنه يسمح التصور من شبكة كاملة من ثلاثي الأبعاد الأوعية الدموية في شبكية العين المعقدة والشعيرات الدموية من خلال خلق ثنائية الأبعاد مسطحة جبل من القنوات المترابطة الأوعية الدموية بعد هضم مكونات غير الأوعية الدموية في شبكية العين. هذا يسمح احد لدراسة مختلف التغيرات المرضية الوعائية، مثل microaneurysms، انحطاط الشعرية، والبطانية غير طبيعية إلى نسب خلية حوطية. ومع ذلك، فإن هذه الطريقة صعبة من الناحية التقنية، لا سيما في الفئران، التي أصبحت نموذج حيواني معظم المتاحة على نطاق واسع لدراسة شبكية العين بسبب سهولة التلاعب الجيني 6،7. في العين الماوس، فإنه من الصعوبة بمكان إزالة المكونات غير والأوعية الدموية مع الحفاظ على الهيكل العام للأوعية الدموية في شبكية العين. حتى الآن، ليس هناك ندرة في الأدبيات التي تصف هضم تقنية التربسين بالتفصيل أنان الماوس. يقدم هذا المخطوط منهجية خطوة بخطوة مفصل للهضم التربسين في الماوس شبكية العين، في الوقت الذي توفر أيضا نصائح حول مخرج الخطوات الصعبة.
Introduction
تصور الأوعية الدموية في شبكية العين نهجا هاما للغاية لتشريح آليات أمراض العيون المختلفة مثل اعتلال الشبكية السكري. فإنه يسمح احد لتقييم أقرب شذوذ الأوعية الدموية، بما في ذلك microaneurysms، انحطاط الشعرية، وفقدان خلية حوطية 8،9. حتى الآن، كانت هناك العديد من التقنيات المتقدمة لتحليل الأوعية الدموية في شبكية العين. وقد استخدم نضح من مختلف الأصباغ لتسليط الضوء على السفن، ولكن كل تقاسمت قيود مماثلة. حقن نادرا ما يسلط الضوء على الأوعية الدموية في شبكية العين بأكملها ما لم يعطى في الضغط العالي، الذي يهدد بتمزيق واتلاف الاوعية 1. المناعية من بطانة الأوعية الدموية مع fluorophore المسمى G isolectin B4 (اليكسا فلور 594 مترافق؛ I21413؛ إينفيتروجن؛ 1:100 تمييع) يمكن أن يتصاعد وشقة الشبكية تسليط الضوء على البنية الكلية للسفن، ولكن من دون عرض التصور من الشعيرات الدموية والأغشية الطابق السفلي وpericytes . ولوحظ من قبلFriedenwald أن السفن يمكن إبراز بواسطة تلطيخ مسطحة يتصاعد من شبكية العين مع الدوري حمض شيف (PAS) أو الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ 10. ومع ذلك، كان تلطيخ غير محددة إلى السفن وسلطت الضوء على الأنسجة غير والأوعية الدموية وكذلك، مما يجعل من الصعب التفريق بين الأوعية. في 1960s، وضعت كوجان وكوابارا تقنية هضم التربسين التي جعلت من السهل تصور الأوعية الدموية في شبكية العين عن طريق هضم مكونات اوعائي من شبكية العين 1. منذ ذلك الوقت، أصبح التربسين هضم طريقة المعيار الذهبي في تحليل الأوعية الدموية للشبكية العين 2-5. ومع ذلك، فمن المهم أن نلاحظ أن تقنيات بديلة أخرى لعزل الأوعية الدموية وقد وصفت. وقد استخدمت استخدام تحلل التناضحي لعزل الأوعية الدموية والسماح الدراسات البيوكيميائية في الأنسجة 11،12، ولكن لم يتم استخدامه الإجراء كوسيلة الأولية للدراسة تشريحية. لقد كان الأسلوب Print الأنسجةتستخدم لعزل قطاعات واسعة من الأوعية الدموية الدقيقة ويسمح للقدرة لدراسة الهندسة المعمارية تيار كهربي من الأوعية الدموية 13. من الناحية النظرية، ويمكن أيضا أن هذه التقنية يمكن استخدامها لدراسة التغيرات التشريحية، كما نوعية السفن عالية. ومع ذلك، أنها قادرة على عزل أجزاء من شبكة الأوعية الدموية بأكملها فقط. على الرغم من أن هذه الأساليب لا يمكن أن تحل محل التربسين هضم، فمن المهم أن نلاحظ أن لديهم مزايا وعيوب مختلفة ومكملة في هذا الصدد.
طريقة هضم التربسين يمثل تحديا تقنيا ويصعب تنفيذ باستمرار 6،7. وعلاوة على ذلك، لوحظ أن التربسين هضم من الصعب خصوصا على نموذج الفأر، ولا سيما إذا كان أحد يرغب في الحفاظ على بنية الأوعية الدموية الشاملة للشبكية العين 6،7. وتشمل التحديات (1) الإفراط في الهضم من شبكية العين الذي يسبب خسارة كل من الأوعية الدموية وكذلك الأنسجة غير والأوعية الدموية، (2) وكيل الهضم، وتتطلبتشريح الميكانيكية واسعة النطاق والتي يمكن أن تؤدي بدورها إلى التلف من السرير السفينة، (3) فصل الفقيرة من الأنسجة غير والأوعية الدموية من الأوعية الدموية مما يؤدي إلى تلطيخ غير محددة. وقد أبرزت العديد من المخطوطات لهذه التحديات، ولكن قدمت بلا بروتوكول مفصلة ومتسقة للتغلب عليها 14،15. وهذه المخطوطة تقديم منهجية خطوة بخطوة تفاصيل تقنية لتنفيذ التربسين هضم في شبكية العين الماوس والفئران مع نصائح محددة بشأن التعامل مع خطوات صعبة بشكل خاص. يتم عرض لمحة التخطيطي في الشكل 1.
Protocol
Representative Results
Discussion
التربسين هضم هي طريقة قياسية لتقييم الأوعية الدموية في شبكية العين. لسوء الحظ، فإنه يمثل تحديا تقنيا ويمكن أن يؤدي إلى ارتفاع معدل فقدان العينة إذا لم يتم تنفيذ بشكل صحيح. وعلاوة على ذلك، فإن الإجراء صعب وخاصة في الفئران، والتي يمكن أن تحد من تطبيق هذه التقنية في النم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل جزئيا من قبل المعاهد الوطنية للصحة RO1-EY019951 (AAF)، جمعية إلينوي للوقاية من العمى (JCC، AAF)، والأموال غير المقيد إلى قسم العيون من البحوث للوقاية من العمى (RPB)، NY وRPB الطبية زمالة طالب المنحة (JCC).
Materials
| REAGENTS | |||
| 10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | |
| Trypsin (1:250) | Amresco | 0458-50G | Make 3% trypsin in 0.1 M Tris |
| TRIZMA base | Sigma | T1503-1KG | Create 0.1 M Tris Buffer (pH 7.8 @ 37 °C) |
| TRIZMA | Sigma | T3253-500G | |
| Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
| EQUIPMENT | |||
| Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. (10x is sufficient with working distance of 24 mm) | ||
| Straight scissors | Fine Science Tools | 15024-10 | Cutting edge: 8 mm; Tip diameter: 0.2 mm; 10 cm |
| Straight Forceps (Inox) | Dumont #5 | 11252-20 | Biologie tip; 0.05 x 0.02 mm; 11 cm |
| Curved Forcepts (Dumostar) | Dumont #7 | 11297-10 | Biologie tip; 0.07 x 0.04 mm; 11.5 cm |
| Dubnoff Metabolic Shaker Incubator | Precision Scientific | BDG59442 | Shaker optional |
| 24-well dish | Falcon | 353047 | |
| Microscope Slides | VWR | 82027-132 |
References
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Studies of retinal vascular patterns. I. Normal architecture. Arch. Ophthalmol. 64, 904-911 (1960).
- Kuwabara, T., Cogan, D. G. Retinal vascular patterns. VII. Acellular change. Invest. Ophthalmol. 4, 1049-1064 (1965).
- Bell, W. R., Green, W. R., Goldberg, M. F. Histopathologic and trypsin digestion studies of the retina in incontinentia pigmenti. Ophthalmology. 115, 893-897 (2008).
- Danis, R. P., Wallow, I. H. HRP/trypsin technique for studies of the retinal vasculature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 434-437 (1986).
- Kim, S. H., Chu, Y. K., Kwon, O. W., McCune, S. A., Davidorf, F. H. Morphologic studies of the retina in a new diabetic model; SHR/N:Mcc-cp rat. Yonsei Med. J. 39, 453-462 (1998).
- Cuthbertson, R. A., Mandel, T. E. Anatomy of the mouse retina. Endothelial cell-pericyte ratio and capillary distribution. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 27, 1659-1664 (1986).
- Laver, N. M., Robison, W. G., Pfeffer, B. A. Novel procedures for isolating intact retinal vascular beds from diabetic humans and animal models. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 34, 2097-2104 (1993).
- Midena, E., et al. Studies on the retina of the diabetic db/db mouse. I. Endothelial cell-pericyte ratio. Ophthalmic Res. 21, 106-111 (1989).
- . Chapter 30. Diabetic Retinopathy. , (2005).
- Rosenblatt, B., Benson, W. E., Yannoff, M., Duker, J. Chapter 6.19 Diabetic Retinopathy. Ophthalmology. , (2008).
- Friedenwald, J. S. A new approach to some problems of retinal vascular disease. Am. J. Ophthalmol. 32, 487-498 (1949).
- Podesta, F., et al. Bax is increased in the retina of diabetic subjects and is associated with pericyte apoptosis in vivo and in vitro. Am. J. Pathol. 156 (10), 1025-1032 (2000).
- Dagher, Z., et al. Studies of rat and human retinas predict a role for the polyol pathway in human diabetic retinopathy. Diabetes. 53, 2404-2411 (2004).
- Puro, D. G. Retinovascular physiology and pathophysiology: new experimental approach/new insights. Prog. Retin. Eye Res. 31, 258-270 (2012).
- Roy, S., Nasser, S., Yee, M., Graves, D. T., Roy, S. A long-term siRNA strategy regulates fibronectin overexpression and improves vascular lesions in retinas of diabetic rats. Mol. Vis. 17, 3166-3174 (2011).
- Li, Q., et al. Diabetic eNOS-knockout mice develop accelerated retinopathy. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 51, 5240-5246 (2010).
- Connor, K. M., et al. Quantification of oxygen-induced retinopathy in the mouse: a model of vessel loss, vessel regrowth and pathological angiogenesis. Nature Protocols. 4, 1565-1573 (2009).
