Paddelstange: Verwaltung Alkohol zu Flies
Summary
Drosophila ist als bedeutsamer Modellsystem zum Zerlegen der zellulären und molekularen Grundlagen von Verhaltensreaktionen auf Alkohol entstanden. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Sammlung von Alkohol Empfindlichkeit von Daten in einem zirkadianen Kontext, die leicht auf andere Experimente angewendet werden kann und ist für Bachelor-Forschung gut geeignet.
Abstract
Fruchtfliegen (Drosophila melanogaster) sind ein etabliertes Modell sowohl für Alkoholforschung und circadianen Biologie. Kürzlich haben wir gezeigt, dass die innere Uhr moduliert Alkoholempfindlichkeit, aber nicht die Bildung von Toleranz. Hier beschreiben wir unser Protokoll im Detail. Alkohol wird den Fliegen mit dem Paddelstange verabreicht. Bei diesem Aufbau wird gesättigten Alkohol mit Dampf befeuchtete Luft in der Serie Verhältnissen gemischt, und die Fliegen in vier Röhrchen gleichzeitig verabreicht werden. Fliegen sind unter standardisierten Bedingungen, um die Abweichung zwischen den Replikaten minimieren aufgezogen. Drei Tage alte Fliegen der verschiedenen Genotypen oder Behandlungen werden für die Experimente bevorzugt durch Anpassen entfernt von zwei verschiedenen Zeitpunkten (z. B. CT 5 und CT 17) direkte Vergleiche möglich eingesetzt. Während des Versuchs werden entfernt für 1 h in den vorbestimmten Prozentsatz der Alkoholdampf und der Anzahl von Fliegen, die den Verlust des Stellreflexes (LORR) aufweisen ausgesetzt oder Sedation werden alle 5 min gezählt. Die Daten können unter Verwendung von drei verschiedenen statistischen Methoden analysiert werden. Die erste ist die Zeit, bei der 50% der Fliegen ihre Aufrichtungsreflexes verloren bestimmen und eine Analyse der Varianz (ANOVA), um festzustellen, ob wesentliche Unterschiede zwischen den Zeitpunkten vorhanden sein. Die zweite ist die Prozent Fliegen, die LORR zeigen nach einer bestimmten Anzahl von Minuten, gefolgt von einer ANOVA-Analyse zu bestimmen. Die letzte Methode ist, um die gesamte Zeitreihe mit multivariaten Statistiken zu analysieren. Das Protokoll kann auch für Nicht-circadianen Experimente oder Vergleiche zwischen Genotypen verwendet werden.
Introduction
Drosophila melanogaster zeigen zweiphasige Verhaltensreaktionen auf Alkohol ein, die analog zu menschlichen Reaktionen auf dieses Medikament 2,3 sind. Bei der ersten Exposition gegenüber niedrigen Konzentrationen von Alkohol, fliegt eine erhöhte Bewegungsaktivität, durch einen Mangel an Bewegungskoordination, den Verlust der Haltungskontrolle und Stellreflexe (Verlust des Stellreflexes: LORR) ersetzt, und Sedierung (vollständige Fehlen der motorischen Aktivität in Reaktion auf mechanische Stimulation) die Exposition gegenüber Alkohol fort 4-9. Die endogenen circadianen Uhr ist ein starker Modulator von Alkohol Empfindlichkeit und Toxizität in Mäusen 10,11, 12 Ratten beobachtet, und Menschen 13. Jüngste Fortschritte in der Drosophila-Forschung haben gezeigt, die innere Uhr moduliert akuten Alkoholempfindlichkeit, aber nicht ein Alkoholtoleranz. Die leistungsfähigen genetischen Ansätzen in Drosophila-Mutanten verfügbar durch Studien und transgenen Manipulationen der Raumund zeitliche Genexpression ein System, das eine schnelle Fortschritte bei der Identifizierung der zugrunde liegenden zellulären und molekularen Mechanismen für komplexe Verhalten ermöglicht. Die Verwendung von Drosophila als Untersuchungswerkzeug hat inhaltliche Fortschritte im Verständnis der Neurobiologie Alkohol, die schnell zu den Säugetieren 14-16 übersetzt werden kann, erlaubt. Um das Verständnis der molekularen Mechanismen, durch die der circadianen Uhr moduliert Alkohol Empfindlichkeit zu erleichtern und Verhaltensreaktionen über zirkadianen Zeitpunkten, eine Alkoholverwaltung Protokoll für den Einsatz bei schlechten Lichtverhältnissen rot gleichmäßig zu messen ist nicht erforderlich. Für Drosophila kann Alkohol durch Nahrungsergänzung für die chronische Exposition oder zuverlässig durch die Verwaltung Alkohol in Form von Dampf für die akute Exposition verabreicht werden. Hier ein Alkoholverwaltung Protokoll für die Beurteilung der Modulation der zirkadianen Loss-of-Stellreflex (LORR) 1 als auch beschreiben wirSedierung.
12-Stunden-LD-Zyklen bei konstanter Temperatur und dann auf eine gesteuerte Lichtregelung für 2-5 Tage, je nach Versuchs Frage übertragen: Fliegen sind mit 12 Stunden mitgenommen. Fliegen sind zu Ethanol Dampf in einem Gerät wie der Paddelstange bekannte ausgesetzt. In dieser Vorrichtung werden gesteuerte Mengen von Luft durch Wasser und Alkohol blasen; die Dämpfe werden dann gemischt und in eine Ampulle Gehäuse die Fliegen gerichtet. Alle 5 min die Fliegen für die Nummer, die angezeigt werden Stellreflexe oder haben sich nicht sediert erzielt. LORR Prozentsätze für jeden Zeitpunkt berechnet werden und unter zirkadianen Zeitpunkten oder zwischen Stämmen verglichen entfernt. Die Einfachheit und Zuverlässigkeit der Lieferung Alkohol mit der Paddelstange Alkohol Lieferung kombiniert mit Verhaltensanalyse-Optionen bietet einen bedeutenden Vorteil für circadiane Experimente unter dunklen Bedingungen durchgeführt.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die Kosten für Alkoholmissbrauch und Alkoholismus für die Gesellschaft ist enorm, sowohl in Bezug auf die menschliche und wirtschaftliche Kosten 29 30,31. Drosophila als Modell bietet eine schnelle und vielseitiges System, um schnell prüfen, die Verhaltensreaktionen von einer großen Zahl von Individuen und als solche wurde ausführlich sowohl für Alkohol 5,7,32-34 und circadianen Forschung 35-37 verwendet.
Hier haben wir beschrieben, ein einfach…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Finanzierung dieser Forschung wurde von einem Programm in Neuroscience Award von der Florida State University College of Medicine und die Unterstützung von der Abteilung für Biowissenschaften an der FSU zur Verfügung gestellt. Zusätzliche Finanzierung wurde durch einen Grant-in-Aid aus der Spirituosenherstellerforschungsfonds zur Verfügung gestellt.
Materials
| Alcohol 190 proof | Various | ||
| Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
| Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
| Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
| 120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
| Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
| Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
| Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
| Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
| Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
| Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
| Vial | VWR | 89092-722 | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
| 5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
| Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
| Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
| Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
| Very fine nylon netting | VWR | Various | |
| 15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
| Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
| Mini Flashlights with red filters | Mag-light |
References
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