Drosophila a émergé comme un système modèle important pour disséquer les fondements cellulaires et moléculaires de réponses comportementales à l'alcool. Nous présentons ici un protocole pour la collecte de données sur la sensibilité de l'alcool dans un contexte circadien qui peut être facilement appliquée à d'autres expériences et est bien adapté pour la recherche de premier cycle.
Les mouches des fruits (Drosophila melanogaster) sont un modèle établi pour la recherche de l'alcool et de la biologie circadienne. Récemment, nous avons montré que l'horloge circadienne module la sensibilité à l'alcool, mais pas la formation de la tolérance. Ici, nous décrivons notre protocole en détail. L'alcool est administré à vol utilisant la barre stabilisatrice. Dans cette configuration, la vapeur d'alcool saturé est mélangé avec l'air humidifié dans des proportions fixes, et administré à vol dans quatre tubes simultanément. Les mouches sont élevées dans des conditions normalisées de manière à minimiser la variation entre les répétitions. Trois jours anciens mouches de différents génotypes ou de traitements sont utilisés pour les expériences, de préférence par vol de deux points différents dans le temps (par exemple, CT 5 et CT 17) de faire des comparaisons directes possible correspondant. Pendant l'expérience, les mouches sont exposés pendant 1 heure pour le pourcentage prédéterminé de la vapeur d'alcool et le nombre de mouches qui présentent la perte du réflexe de redressement (Lorr) ou sedation sont comptées toutes les 5 min. Les données peuvent être analysées selon trois approches statistiques différentes. La première consiste à déterminer l'heure à laquelle 50% des mouches ont perdu leur réflexe de redressement et en utilisant une analyse de la variance (ANOVA) pour déterminer s'il existe des différences significatives entre les points dans le temps. Le second est de déterminer le pourcentage des mouches qui montrent Lorr après un certain nombre de minutes, suivie d'une analyse de variance. La dernière méthode est d'analyser l'ensemble des séries chronologiques en utilisant les statistiques multivariées. Le protocole peut également être utilisé pour des expériences ou des comparaisons non circadiens entre les génotypes.
Drosophila melanogaster démontrer réponses comportementales biphasique à l'alcool 1 qui sont analogues aux réponses humaines à ce médicament 2,3. Lors de l'exposition initiale à de faibles concentrations d'alcool, les mouches augmentation de l'activité locomotrice d'exposition, remplacé par un manque de coordination motrice, la perte du contrôle postural et les réflexes de redressement (perte du réflexe de redressement: Lorr), et une sédation (absence complète de l'activité du moteur en réponse à la stimulation mécanique) que l'exposition à l'alcool progresse 4-9. L'horloge circadienne endogène est une forte modulateur de la sensibilité de l'alcool et de la toxicité comme observé chez les souris, les rats 10,11 12, et les humains 13. Les avancées récentes dans la recherche drosophile ont montré l'horloge circadienne module sensibilité aiguë à l'alcool mais pas tolérance à l'alcool 1. Les approches génétiques puissants disponibles chez la drosophile par des études de mutants et les manipulations transgéniques de l'espaceet l'expression des gènes temporelle fournir un système qui permet de rapides progrès dans l'identification des mécanismes cellulaires et moléculaires sous-jacents aux comportements complexes. L'utilisation de la drosophile comme un outil d'enquête a permis des avancées importantes dans la compréhension de la neurobiologie de l'alcool qui peuvent être traduits rapidement aux mammifères 14-16. Afin de faciliter la compréhension des mécanismes moléculaires par lesquels l'horloge circadienne module la sensibilité à l'alcool et à mesurer de manière uniforme à travers les réponses comportementales points de temps circadiens, un protocole d'administration de l'alcool approprié pour une utilisation dans des conditions de faible lumière rouge est nécessaire. Pour la drosophile, l'alcool peut être administré par une supplémentation alimentaire pour une exposition chronique ou de manière fiable grâce à l'administration d'alcool sous forme de vapeur pour des expositions aiguës. Ici, nous décrivons un protocole d'administration d'alcool approprié pour l'évaluation de la modulation circadienne de la perte-de-réflexe (Lorr) 1 ainsi quesédation.
Les mouches sont entraînés avec 12 h: 12 h cycles LD à température constante, puis transférés à un régime de lumière contrôlée pendant 2-5 jours en fonction de la question expérimentale. Les mouches sont exposés à la vapeur d'éthanol dans un dispositif connu sous le nom la barre stabilisatrice. Dans ce dispositif, des quantités contrôlées d'air sont à barboter dans l'eau et l'alcool; les vapeurs sont ensuite mélangés et dirigés dans un boîtier flacon les mouches. Toutes les 5 min vol sont marqués pour le nombre que ne parvient pas à afficher redressement réflexes ou sont devenus des sédatifs. Pourcentages Lorr pour chaque point de temps sont calculés et comparés entre les points de temps circadiens ou entre les souches de mouches. La simplicité et la fiabilité de la livraison d'alcool en utilisant la livraison d'alcool barre stabilisatrice combinée avec des options d'analyse comportementale fournit un avantage significatif pour les expériences menées circadiens dans des conditions sombres.
Les coûts de l'abus d'alcool et l'alcoolisme pour la société est énorme, tant en termes de coûts humains et économiques 29 30,31. Drosophile comme modèle propose un système rapide et souple pour examiner rapidement les réponses comportementales d'un grand nombre d'individus et en tant que tel a été largement utilisé à la fois pour la recherche et l'alcool 5,7,32-34 circadien 35-37.
Ici, nous avons décrit un proto…
The authors have nothing to disclose.
Le financement de cette recherche a été assuré par un programme en neurosciences Prix de la Florida State University College of Medicine et le soutien du Département de sciences biologiques à l'ex-URSS. Le financement supplémentaire a été fourni par une subvention en aide provenant du Fonds de recherche de la vente d'alcool Fabricant.
Alcohol 190 proof | Various | ||
Name of Material | Company | Catalog Number | Comments |
Aerator | Local pet store | We use Whisper 60 | |
Silicone tubing 1/8” | VWR | 408060-0030 | |
120° Y Connector | VWR | 82017-256 | |
Quick disconnects | VWR | 46600-048 | |
Plastic tube clamps | Bell-art products | 132250000 | Either this or next |
Miniature Air Regulator | McMaster-Carr | 8727K11 | Either this or previous |
Miniature Air Regulator Mounting Bracket | McMaster-Carr | 9891K66 | |
Gilmont size 12 flow meter | VWR | 29895-242 | |
Tool clips | McMaster-Carr | 1722A43 | To hold flow meters |
Vial | VWR | 89092-722 | |
Rubber stopper with two holes | VWR | 59585-186 | Fits in vials |
5 mm Pyrex Glass tubes | Trikinetics | PGT5x65 | Fits best in previous stopper. |
Teflon tape | Hardware store | To achieve snug fit in stoppers if necessary | |
Rubber stopper with two holes | VWR | 59582-122 | Fits our bottles |
Disposable glass pipets | VWR | 53283-768 | Cut to length and bend by heating |
Very fine nylon netting | VWR | Various | |
15 watt bulbs | Hardware store | Overhead red light | |
Photographic red safe light filters | Overhead red light | ||
Mini Flashlights with red filters | Mag-light |