Implementação da braçadeira dinâmico com Condutâncias Synaptic e Artificial em células ganglionares da retina do rato
Summary
Este artigo vídeo ilustra os set-up, os procedimentos para consertar os corpos celulares e como implementar as gravações braçadeira dinâmicas a partir de células ganglionares em todo o monte do mouse retina. Esta técnica permite a investigação da contribuição precisa de inputs sinápticos excitatórios e inibitórios, e sua magnitude relativa e tempo para spiking neuronal.
Abstract
As células são os neurónios do gânglio da retina de saída e da sua actividade reflecte a integração de múltiplas entradas sinápticas neuronais decorrentes de circuitos específicos. Técnicas de patch clamp, na braçadeira de tensão e configurações de fixação atuais, são comumente usados para estudar as propriedades fisiológicas dos neurônios e caracterizar suas entradas sinápticas. Embora a aplicação destas técnicas é altamente informativos, que representam várias limitações. Por exemplo, é difícil de quantificar a forma como as interacções precisas das entradas excitatórios e inibitórios determinar saída de resposta. Para resolver esse problema, usamos uma técnica de modificação actual braçadeira, braçadeira de dinâmica, também chamada de condutância braçadeira 1, 2, 3 e examinou o impacto dos insumos sinápticos excitatórios e inibitórios na excitabilidade neuronal. Esta técnica requer a injecção de corrente para dentro da célula e é dependente da realimentação em tempo real o seu potencial de membrana em que o tempo. O INJECTEd atual é calculado a partir predeterminados condutâncias sinápticos excitatórios e inibitórios, suas potencialidades e potencial reversão instantânea membrana da célula. Os detalhes sobre os procedimentos experimentais, as células de fixação adesivo para conseguir uma configuração de célula inteira e emprego da técnica de fixação dinâmico são ilustradas neste artigo de vídeo. Aqui, mostramos as respostas das células ganglionares da retina de rato a várias formas de onda de condutância obtidos a partir de experiências de controlo em condições fisiológicas, ou na presença de fármacos. Além disso, mostram o uso de condutâncias excitatórios e inibitórios artificiais gerados usando funções alfa para investigar as respostas das células.
Introduction
A retina é um tecido neural quase transparente que reveste a parte de trás do olho. Muitos estudos utilizam a retina como modelo para investigar os primeiros passos de processamento visual e os mecanismos de sinalização sinápticos. Uma vez que a rede de retina na preparação de toda a montagem permanece intacta após a dissecação,, representa um sistema ideal para estudar interacções sinápticas como as suas respostas fisiológicas são muito semelhantes à condições in vivo. Assim, usando uma retina isolado as propriedades de seus neurônios pode ser estudado usando técnicas de patch clamp (por comentários sobre a técnica, ver 6,9,13). Identificação da contribuição exacta dos circuitos e de neurotransmissores na resposta a células ganglionares específicos, no entanto, é geralmente dificultado actuar como agentes farmacológicos em vários sites.
Respostas fisiológicas de neurônios da retina à luz, a estímulos naturais, podem ser gravados com pipetas de vidro preenchidos com fluido intracelular. Usando cl remendotécnicas ampères, respostas neuronais à estimulação de luz pode ser registrado como flutuações potenciais de membrana (pinça de corrente) ou como correntes (braçadeira de tensão). Ao manter o potencial de membrana a voltagens diferentes e execução de uma análise de condutância a posteriori, é possível isolar entradas sinápticos excitatórios e inibitórios 5,12. Este tipo de experiências pode ser levada a cabo em meio de banho normal e na presença de diferentes agentes farmacológicos para isolar a contribuição de diferentes neurotransmissores e receptores para respostas neuronais. A riqueza de estudos de muitos laboratórios caracteriza a dependência da cravação de saída e entradas excitatórios e inibitórios em propriedades de estímulo, como o tamanho, o contraste, frequências espaciais e temporais, direção, orientação e outras variáveis de estímulo. Embora essas abordagens experimentais fornecem informações sobre a relação entre a saída de pico e entradas sinápticas em função das propriedades de estímulo,interpretação da contribuição de tipos específicos de células e suas entradas sinápticas a excitabilidade das células não é simples. Isto é devido ao facto de as entradas geralmente estimulantes e inibidores variar com as propriedades de estímulo e, assim, não é possível avaliar com precisão o impacto que as alterações em qualquer destas entradas tem sobre spiking neuronal.
Uma abordagem alternativa para contornar essas limitações é realizar gravações braçadeira dinâmicos, que permitem uma avaliação crítica da contribuição de entradas sinápticas individuais para cravação de saída. A técnica de fixação dinâmica permite que a injecção directa de corrente para dentro da célula e a quantidade de corrente injectada num dado tempo depende do potencial da membrana registado naquele momento 1,2,3 (para revisão, ver 7,14). É uma pinça de corrente modificado set-up onde um tempo real, a interacção entre o retorno rápido de células sob o equipamento de gravação e que compreende hardware especializado, softwaree um computador é alcançado. A quantidade de corrente injectada para dentro da célula é calculado de acordo. Assim, a vantagem deste método é que a célula pode ser estimulada com diferentes combinações de formas de onda de condutância, e da sua resposta vai imitar a activação dos receptores que medeiam as entradas sinápticas. Por exemplo, a comparação da resposta à injecção de condutâncias excitatórios e inibitórios para um pequeno ponto com a resposta à injecção de condutância excitatória para uma pequena mancha apenas fornece informação sobre os efeitos da inibição da resposta celular. Da mesma forma, outras combinações de condutâncias fisiologicamente gravados podem ser co-injetado para revelar como as mudanças nas condutâncias excitatórios e / ou inibitórios estímulo-dependente afeta a saída de pico.
No nosso estudo, a técnica de fixação dinâmico é usado para demonstrar o impacto da amplitude relativa e de sincronização de entradas sinápticas nas propriedades de queima de células ganglionares da retina. Vários condutânciasobtidas a partir de experiências de controlo, em condições fisiológicas, ou na presença de agentes farmacológicos foram utilizados como entradas. Além disso, as condutâncias artificiais baseados em funções alfa também foram utilizados para investigar a forma como entradas sinápticas são integrados pelos neurónios. Assim, esta é uma técnica versátil, que permite que os vários tipos de condutância gerado ou fisiologicamente ou farmacologicamente computacionalmente para ser injectado na mesma célula ganglionar, para comparação de respostas a estas entradas podem ser feitas.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aqui demonstramos a utilização de uma pinça dinâmico para avaliar a influência da proporção e temporização relativa de excitação e de inibição sobre a produção de células ganglionares da retina. Braçadeira dinâmica faz uso de simulações de computador para introduzir condutâncias sinápticas fisiologicamente gravados ou artificial em neurônios vivos. Esta metodologia proporciona uma ferramenta interactiva através da qual pode ser modificado condutâncias e injectado neurónios para se calcular a su…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho é apoiado pelo Conselho Australiano de Pesquisa (ARC DP0988227) eo Biomedical Science Research Initiative Grant da Disciplina de Ciências Biomédicas, da Universidade de Sydney. O Amplificador de patch clamp equipamento EPC 8 foi financiado pelo Fundo de inicialização a partir da Disciplina de Ciências Biomédicas, da Universidade de Sydney. O equipamento Instrutech LIH 8 8 Sistema de Aquisição de Dados foi comprado com os fundos de Rebecca L. Cooper Foundation e do Fundo de inicialização a partir da Disciplina de Ciências Biomédicas, da Universidade de Sydney. Gostaríamos de agradecer aos revisores anônimos por suas sugestões e comentários perspicazes.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
- Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
