تنفيذ المشبك الحيوي مع المواصلة متشابك والاصطناعية في خلايا الشبكية العقدة ماوس
Summary
يوضح هذا المقال فيديو مجموعة المتابعة، والإجراءات اللازمة لتصحيح أجسام الخلايا وكيفية تنفيذ تسجيلات المشبك الحيوية من خلايا العقدة في جبل لالجامع الماوس للشبكية. هذا الأسلوب يسمح التحقيق في مساهمة الدقيق للمدخلات متشابك مثير والمثبطة، وحجمها النسبي وتوقيت لالتشويك العصبية.
Abstract
خلايا العقدة هي الخلايا العصبية الناتج من شبكية العين ويعكس نشاطهم دمج مدخلات متشابك المتعددة التي تنشأ من الدوائر العصبية المحددة. تقنيات المشبك التصحيح، المشبك في الجهد وتكوينات الشبك الحالية، وتستخدم عادة لدراسة الخصائص الفسيولوجية للخلايا العصبية لتوصيف ومدخلاتها متشابك. على الرغم من أن تطبيق هذه التقنيات هو غنية بالمعلومات، فإنها تشكل القيود المختلفة. على سبيل المثال، فإنه من الصعب تحديد كيفية التفاعل الدقيق للمدخلات مثير والمثبطة تحديد الانتاج استجابة. لمعالجة هذه المسألة، استخدمنا تقنية تعديل الحالي المشبك، المشبك دينامية، وتسمى أيضا تصرف المشبك 1، 2، 3 ودرست تأثير المدخلات متشابك مثير والمثبطة على استثارة الخلايا العصبية. هذا الأسلوب يتطلب حقن التيار في الخلية وتعتمد على ردود الفعل في الوقت الحقيقي من غشاء المحتملة لها في ذلك الوقت. وinjecteيتم احتساب د الحالي من المواصلة محددة سلفا متشابك مثير والمثبطة، إمكانات انعكاس وإمكاناتهم الخلية غشاء حظية. ، ويوضح التفاصيل بشأن إجراءات تجريبية التصحيح لقط الخلايا لتحقيق تكوين خلية كاملة وتوظيف تقنية المشبك دينامية في هذه المقالة الفيديو. هنا، نقدم لك مجموعة من الردود من خلايا الشبكية العقدة الماوس لمختلف الطول الموجي تصرف تم الحصول عليها من التجارب الفسيولوجية في ظروف التحكم أو في وجود مخدرات. وعلاوة على ذلك، نقدم لك مجموعة من استخدام المواصلة مثير والمثبطة اصطناعية تم إنشاؤها باستخدام وظائف ألفا للتحقيق في استجابات الخلايا.
Introduction
شبكية العين هي الأنسجة العصبية شبه شفافة بطانة الجزء الخلفي من العين. العديد من الدراسات استخدام شبكية العين كنموذج للتحقيق الخطوات الأولى في المعالجة البصرية وآليات إشارات متشابك. منذ الشبكة الشبكية في إعداد كامل جبل لا يزال سليما بعد تشريح، لأنها تمثل نظام مثالي لدراسة التفاعلات متشابك كما ردودها الفسيولوجية هي مشابهة جدا لفي ظروف فيفو. وهكذا، وذلك باستخدام شبكية العين معزولة يمكن دراسة خصائص الخلايا العصبية وذلك باستخدام تقنيات المشبك التصحيح (على الاستعراضات على هذه التقنية، نرى 6،9،13). تحديد مساهمة الدقيق للدوائر والناقلات العصبية إلى استجابة الخلايا العقدية المحددة، ومع ذلك، وعادة ما أعاق وكلاء الدوائية تعمل في مواقع مختلفة.
يمكن تسجيل الاستجابات الفسيولوجية للخلايا العصبية في شبكية العين للضوء، والتحفيز الطبيعي، مع ماصات زجاجية مملوءة السوائل داخل الخلايا. باستخدام معدل التصحيحيمكن تسجيل تقنيات أمبير، والاستجابات العصبية لتحفيز الضوء عن التقلبات المحتملة غشاء (الشبك الحالية) أو كما التيارات (المشبك الجهد). من خلال عقد غشاء المحتملة في مختلف الجهود وتنفيذ تحليل تصرف اللاحق، فمن الممكن لعزل المدخلات متشابك المثبطة ومثير 5،12. هذا النوع من التجارب يمكن القيام بها في المتوسطة الاستحمام العادي وبحضور وكلاء الدوائية المختلفة لعزل مساهمة الناقلات العصبية والمستقبلات العصبية إلى استجابات مختلفة. هناك ثروة من الدراسات من العديد من المختبرات تتميز اعتماد ارتفاعه الانتاج والمدخلات مثير والمثبطة على خصائص التحفيز مثل حجم، وعلى النقيض، الترددات المكانية والزمانية، والتوجيه، والتوجيه والتحفيز المتغيرات الأخرى. على الرغم من أن هذه المناهج التجريبية تقديم معلومات عن العلاقة بين المخرجات والمدخلات ارتفاع متشابك بوصفها وظيفة من خصائص التحفيز،تفسير مساهمة أنواع معينة من الخلايا ومدخلاتها متشابك إلى استثارة الخلايا ليست واضحة. ويرجع ذلك إلى حقيقة أن المدخلات عادة كل مثير والمثبطة تختلف مع خصائص التحفيز وبالتالي، فإنه ليس من الممكن تقييم التأثير الدقيق أن التغيرات في أي من هذه المدخلات له على التشويك العصبية هذه.
نهج بديل للتحايل على هذه القيود هو القيام تسجيلات المشبك الحيوية، والتي تسمح اجراء تقييم نقدي للمساهمة مدخلات متشابك الفردية إلى ارتفاعه الإخراج. تقنية المشبك دينامية يسمح الحقن المباشر للتيار في الخلية وكمية حقن الحالية في وقت معين يعتمد على غشاء المحتملة سجلت في ذلك الوقت 1،2،3 (للمراجعة، انظر 7،14). بل هو الشبك الحالية المعدلة انشاء حيث في الوقت الحقيقي، والتفاعل ردود فعل سريعة بين الخلية تحت تسجيل والمعدات التي تضم الأجهزة المتخصصة، والبرمجياتويتم التوصل إلى جهاز الكمبيوتر. يتم احتساب مبلغ حقن الحالي في الخلية وفقا لذلك. وبالتالي، فإن ميزة هذا الأسلوب هو أن الخلية يمكن حفز مع مجموعات مختلفة من الطول الموجي تصرف، وسوف ردها تحاكي تنشيط مستقبلات التي تتوسط المدخلات متشابك. على سبيل المثال، مقارنة الاستجابة لحقن المواصلة مثير والمثبطة لبقعة صغيرة مع الاستجابة لحقن تصرف مثير للبقعة صغيرة فقط يوفر معلومات عن تأثير تثبيط على استجابة الخلية. وبالمثل، تركيبات أخرى من المواصلة سجلت الناحية الفسيولوجية يمكن أن يشترك في حقن للكشف عن كيفية التي تعتمد على التحفيز التغييرات في المواصلة مثير و / أو المثبطة تؤثر على انتاج مسمار.
في دراستنا، يتم استخدام تقنية المشبك دينامية للتدليل على أثر السعة وتوقيت مدخلات متشابك على خصائص اطلاق النار من خلايا الشبكية العقدة النسبية. المواصلة مختلفتم الحصول عليها من التجارب الفسيولوجية في ظروف التحكم أو في وجود وكلاء الدوائية كانوا يعملون كمدخلات. وبالإضافة إلى ذلك، استخدمت المواصلة الاصطناعي على أساس وظائف ألفا أيضا من أجل التحقيق في كيفية إدماج المدخلات متشابك من قبل الخلايا العصبية. وبالتالي هذا هو أسلوب متعدد الاستعمالات التي تسمح أنواع مختلفة من تصرف ولدت إما من الناحية الفسيولوجية، ليتم حقنه دوائيا أو حسابيا في نفس الخلايا العقدية، ويمكن إجراء مقارنة ذلك من الاستجابات لهذه المدخلات.
Protocol
Representative Results
Discussion
هنا نقدم لك مجموعة من استخدام المشبك دينامية لتقييم تأثير هذه النسبة، وتوقيت قريب من الإثارة وتثبيط على الشبكية الناتج الخلايا العقدية. المشبك دينامية يجعل من استخدام المحاكاة الحاسوبية لإدخال المواصلة متشابك المسجلة من الناحية الفسيولوجية أو اصطناعية في الخلايا …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
وأيد هذا العمل من قبل المجلس الأسترالي للبحوث (ARC DP0988227) وبحوث العلوم الطبية الحيوية مبادرة منحة من الانضباط في العلوم الطبية الحيوية، جامعة سيدني. المعدات تصحيح مكبر للصوت المشبك EPC 8 تم تمويله من قبل صندوق بدء التشغيل من الانضباط في العلوم الطبية الحيوية، جامعة سيدني. تم شراء معدات InstruTECH دوا 8 +8 نظام الحصول على البيانات مع الصناديق من مؤسسة ريبيكا كوبر L. وصندوق بدء التشغيل من الانضباط في العلوم الطبية الحيوية، جامعة سيدني. ونود أن نشكر المراجعين المجهولين للحصول على اقتراحات بصيرة وتعليقاتهم.
Materials
| Reagent | |||
| Isoflurane Inhalation Anaesthetic | Pharmachem | ||
| Ames Medium with L-Glutamate (Powder) | Sigma-Aldrich | ||
| Potassium Gluconate, Anhydrous | Sigma-Aldrich | ||
| HEPES Sodium salt | Sigma-Aldrich | ||
| Magnesium chloride solution (4.9 mol/l) | Sigma-Aldrich | ||
| Adenosine 5′-triphosphate (ATP) disodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Guanosine 5′-triphosphate sodium salt hydrate | Sigma-Aldrich | ||
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N’,N’-tetraacetic acid | Sigma-Aldrich | ||
| Paraformaldehyde Powder, 95% | Sigma-Aldrich | ||
| Anti-Lucifer Yellow, Rabbit IgG Fraction (3 mg/ml) | Invitrogen | ||
| Alexa Fluor 594 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) 2 mg/ml | Invitrogen | ||
| Fluorescent Preserving Media | BioFX Laboratories Inc. | ||
| Equipment | |||
| Capillary Glass Tubing with flame polished ends (OD = 1.50 mm, ID = 0.86 mm, Length = 15 cm) | Warner Instruments | 64-0794 | |
| Single Stage Glass Microelectrode Puller | Narishinge Japan | Model PP-830 | |
| Minipuls 2 | Gilson | ||
| Millex-GV 0.22 μm Filter Unit | Millipore Corporation | SLGV004SL | |
| Luer Lock Reusable Hypodermic Needle: 30 G | Smith & Nephew (Australia) | ||
| Single Inline Solution Heater | Warner Instruments | Model SH-27B | |
| Dual Automatic Temperature Controller | Warner Instruments | TC-344B | |
| Olympus Stereomicroscope SZ61 | Olympus Corporation | ||
| Olympus Microscope BX50WI: with 40X objective | Olympus Corporation | ||
| 0-30 V 2.5 A DC Power Supply | Dick Smith Electronics | Q1770 | |
| Digital Microscopic Camera ProgResMF cool | Jenoptik | ||
| Micromanipulator MP-225 | Sutter Instrument Company | ||
| Patch Clamp Amplifier EPC 8 | HEKA Elektronik | ||
| InstruTECH LIH 8+8 Data Acquisition System | HEKA Elektronik | ||
| Computer: DELL | Dell Corporation |
References
- Robinson, H. P. C., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of Neuroscience Methods. 49, 157-165 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp: artificial conductances in biological neurons. Trends in Neuroscience. 16, 389-394 (1993).
- Sharp, A. A., O’Neil, M. B., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of Neurophysiology. 69, 992-995 (1993).
- Johnson, D., Wu, S. M. -. S. . Foundations of cellular neurophysiology. , (1995).
- Taylor, W. R., Vaney, D. I. Diverse synaptic mechanisms generate direction selectivity in the rabbit retina. Journal of Neuroscience. 22 (17), 7712-7720 (2002).
- Jurkat-Rott, K., Lehmann-Horn, F. The patch clamp technique in ion channel research. Current Pharmaceutical Biotechnology. 4, 221-238 (2003).
- Prinz, A. A., Abbott, L. F., Marder, E. The dynamic clamp comes of age. Trends in Neuroscience. 27, 218-224 (2004).
- Williams, S. R. Spatial compartmentalization and functional impact of conductance in pyramidal neurons. Nature Neuroscience. 7 (9), 961-967 (2004).
- Perkins, K. L. Cell-attached voltage-clamp and current-clamp recording and stimulation techniques in brain slices. Journal of Neuroscience Methods. 154 (1-2), 1-18 (2006).
- Feng, S. S., Jaeger, D. The role of SK calcium-dependent potassium currents in regulating the activity of deep cerebellar nucleus neurons: a dynamic clamp study. Cerebellum. 7 (4), 542-546 (2008).
- Butera, R., Lin, R., Destexhe, A., Bal, T. Key factors for improving dynamic clamp performance. In: Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series. Dynamic-Clamp From Principles to Applications Series: Springer Series in Computational Neuroscience. 1, (2009).
- Marco, S. D. i., Nguyen, V. A., Bisti, S., Protti, D. A. Permanent functional reorganization of retinal circuits induced by early long-term visual deprivation. The Journal of Neuroscience. 29 (43), 13691-13701 (2009).
- Zhao, Y., Inayat, S., Dikin, D. A., Singer, J. H., Ruoff, R. S., Troy, J. B. Patch clamp technique: review of the current state of the art and potential contributions from nanoengineering. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part N: Journal of Nanoengineering and Nanosystems. 222 (1), 1-11 (2009).
- Lobb, C. J., Paladini, C. A. Application of a NMDA receptor conductance in rat midbrain dopaminergic neurons using the dynamic clamp technique. J. Vis. Exp. (46), e2275 (2010).
- Briggman, K. L., Euler, T. Bulk electroporation and population calcium imaging in the adult mammalian retina. Journal of Neurophysiology. 105 (5), 2601-2609 (2011).
- Middleton, T. P., Protti, D. A. Cannabinoids modulate spontaneous synaptic activity in retinal ganglion cells. Visual Neuroscience. 28 (5), 393-402 (2011).
- Pottek, M., Knop, G. C., Weiler, R., Dedek, K. Electrophysiological characterization of GFP-expressing cell populations in the intact retina. J. Vis. Exp. (57), e3457 (2011).
