In vivo imaging di calcio neuronale in C. elegans

Qui vi presentiamo metodi pratici per imaging in vivo di calcio in C. elegans neuroni. Lo sviluppo di geneticamente codificati calcio-sensibili fluorofori con elevato rapporto segnale-rumore rende C. elegans un sistema relativamente semplice e conveniente per la misurazione di neurofisiologia e di attività. La nostra immagine è fatta con un microscopio standard con largo campo imaging di fluorescenza dei fluorofori comunemente disponibili. Vi presentiamo diverse tecniche che impiegano fluorofori diversi e preparati di campionamento diverse, discutendo i punti di forza e di debolezza di ciascuno. I dati vengono quindi presentato da due esperimenti di esempio. Una risorsa eccellente aggiuntiva sulle tecniche descritte qui possono essere trovati in WormBook, "Imaging l'attività dei neuroni e dei muscoli" di R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

Due classi principali di geneticamenteautomaticamente codificati reporter calcio fluorescenti sono comunemente usati in C. elegans: GCaMP singolo canale e FRET-based cameleon. Noi descrivere i metodi e mostrare esempi di dati generati da ciascuna.

GCaMP si basa su una modifica proteina fluorescente verde (GFP), che è sensibile alla concentrazione di calcio circostante. Questo viene realizzato per fusione GFP e la elevata affinità calmodulina calcio proteina, in modo tale che il legame del calcio da calmodulina porta la molecola di GFP in una conferma efficiente fluorescente ^2. I recenti progressi in questi fluorofori generano dimensioni eccezionali del segnale fino a 500% di aumento di intensità di fluorescenza in un range fisiologico dei livelli di calcio e cinetica ragionevolmente veloci di ~ 95 msec tempo di salita e tempo di decadimento ~ 650 msec ^4. In periodi di tempo relativamente brevi (minuti), questi segnali di grandi dimensioni può consentire l'imaging risoluzione più bassa (inferiore ingrandimento) e, dato un bravo initmisurazione di riferimento ial, negare la necessità di base continuo o misurazioni comparative.

Cameleon ha il vantaggio di essere un FRET-based fluoroforo che genera una misurazione raziometrica confrontando due canali indipendenti o lunghezze d'onda ^1. Si compone di due fluorofori distinti (proteine ​​fluorescenti-ciano e giallo-emissione, CFP e YFP) collegati da una proteina calmodulina. Il complesso è illuminata con luce blu (440 nm) che eccita la PCP. Il legame di calcio porta i fluorofori più vicini, aumentando Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) dal CFP (donatore) alla YFP (accettore) e causando l'emissione PCP (480 nm) per diminuire l'emissione e YFP (535 nm) per aumentare . Relativi livelli di calcio sono misurati come rapporto della YFP / CFP intensità. Cinetica Cameleon sono lento di quello di GCaMP, misurata in vivo per avere un tempo di salita di ~ 1 sec ed un tempo di decadimento di ~ 3 sec ^5. Tuttavia,il rapporto dei segnali contrapposti mobili aumenta la dimensione del segnale e compensa una serie di possibili artefatti dovuti ai cambiamenti nella concentrazione fluoroforo, movimento o deriva fuoco e candeggio.

Geneticamente codificati reporter fluorescenti negare gran parte della preparazione del campione richiesto con esogena sonde amministrati e C. elegans piccolo corpo trasparente permette l'imaging nel intatta di un animale con semplice fluorescenza ampio campo. La principale sfida tecnica nella preparazione del campione è quindi sicuro per immobilizzare gli animali. Ci sono un certo numero di differenti tecniche comunemente utilizzate ciascuno con vantaggi e svantaggi. Utilizzando un agente farmacologico di paralizzare gli animali è facile da implementare e permette il montaggio di animali multiple su una preparazione (Levamisole, un agonista colinergico che causa tessuto muscolare cogliere viene tipicamente usato ^6). C. elegans può anche essere fisicamente immobilizzato da montarliil rigida 10% agarosio ^{7, 8.} Questo impatto minimizza sulla fisiologia degli animali, consente a lungo termine di imaging (ore) e il recupero di animali di più, ma è tecnicamente più difficile. Entrambe queste tecniche limitare l'accesso fisico agli animali (che sono sotto un coprioggetto) e può quindi essere utilizzata solo con determinati stimoli sperimentali (come luce, temperatura, campo elettrico o danni laser). Per stimoli in cui è necessario l'accesso fisico, come il tatto o la somministrazione di prodotti chimici, molti studi hanno successo incollato C. elegans in atto (con colla veterinario grado) ^9. Questo è tecnicamente più impegnativo, è una preparazione singolo animale e non consente il recupero degli animali. Infine, numerosi dispositivi microfluidici sono stati impiegati che fisicamente trattenere C. elegans, preservando fisiologia animale, permettendo l'esposizione alla maggior parte di stimoli (a seconda del modello del dispositivo) e può permettere lo scambio rapido e recupero degli animali <sup> 10, 11. Tuttavia microfluidica richiedono ulteriori competenze tecniche e capacità nella progettazione, fabbricazione e realizzazione. In immobilizzato attività animali e stimolo risposta può generalmente essere misurato in sensoriale e interneuroni. Attività dei neuroni motori richiede tecniche più sofisticate per immagini negli animali in movimento. Qui presenteremo metodi dettagliati che impiegano i due tecniche più semplici di paralisi farmacologica e immobilizzazione rigida con agarosio.

I metodi presentati qui possono essere usati per misurare l'attività neuronale e fisiologia cellulare in C. elegans. Diamo un esempio di ciascuna: utilizzando GCaMP per misurare la risposta sensoriale del neurone ASJ ad un campo elettrico esterno, e utilizzando cameleon per misurare la risposta fisiologica di calcio al danno laser di un neurone. Questi esempi mostrano i vantaggi e gli inconvenienti dei due tipi di fluorofori e illustrare cosa è possibile con il sistema.