Na imagem cálcio vivo Neuronal em C. elegans

Aqui apresentamos métodos práticos para em imagens de cálcio vivo em C. neurônios elegans. O desenvolvimento de codificados geneticamente cálcio sensíveis fluoróforos com relação sinal-para-ruído de alto torna C. elegans um sistema relativamente simples e de baixo custo para a medição da neurofisiologia e da atividade. Nossa imagem é feita com um microscópio composto padrão, utilizando de campo amplo imagens de fluorescência de fluoróforos disponíveis correntemente. Nós apresentamos várias técnicas que empregam vários fluoróforos e preparações diferentes de amostra, discutir os pontos fortes e fracos de cada um. Os dados são então apresentados a partir de duas experiências de exemplo. Um excelente recurso adicional sobre as técnicas descritas aqui podem ser encontrados em WormBook, "Imaging a actividade dos neurónios e músculos" por R. Kerr, ( http://www.wormbook.org ) ^3.

Duas grandes classes de geneticacamente codificados repórteres cálcio fluorescentes são comumente usados ​​em C. elegans: GCaMP único canal e FRET baseada cameleon. Vamos descrever métodos e mostrar exemplos de dados gerados por cada um.

GCaMP baseia-se numa modificação Green Fluorescent Protein (GFP) que é sensível à concentração de cálcio circundante. Isto é realizado através da fusão de GFP e a alta afinidade da proteína de cálcio calmodulina, de tal modo que a ligação do cálcio por calmodulina traz a molécula GFP em uma confirmação eficiente fluorescente ^2. Os avanços recentes no tamanho destes fluoróforos gerar sinal excepcional com aumento até 500% na intensidade de fluorescência ao longo de um intervalo fisiológico dos níveis de cálcio e de cinética razoavelmente rápidos de ~ 95 ms de tempo de subida e o tempo de decaimento ~ 650 mseg ^4. Ao longo de períodos de tempo relativamente curtos (min), estes sinais grandes podem permitir a imagiologia de resolução mais baixa (inferior a ampliação) e, dado um bem comportado o initaferição ial, negar a necessidade de linha de base contínua ou medições comparativas.

Cameleon tem a vantagem de ser um fluoróforo com base em FRET, que gera uma medição raciométrica comparando dois canais independentes ou comprimentos de onda ^1. É constituída por dois fluoróforos separadas (ciano e amarelo emissores de proteínas fluorescentes, PCP e YFP) ligadas por uma proteína calmodulina. O complexo é iluminado com luz azul (440 nm) que excita o PCP. A ligação de cálcio traz os fluoróforos mais juntos, o aumento de transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), a partir da PCP (dador) para o YFP (aceitador) e provocando a emissão de PCP (480 nm) para diminuir a emissão e YFP (535 nm) para aumentar . Os níveis de cálcio são medidos em relação como a razão entre a intensidade de YFP / PCP. Cinética Cameleon são mais lentos do que a de GCaMP, medido in vivo para ter um tempo de subida de uma sec ~ e um tempo de decaimento de ~ 3 seg ^5. No entanto,a razão entre os sinais que se deslocam em oposição aumenta o tamanho do sinal e compensa para um certo número de possíveis artefactos devido a alterações na concentração de fluoróforo de movimento, ou o desvio de focagem e de branqueamento.

Codificados geneticamente repórteres fluorescentes anular grande parte da preparação da amostra necessária com sondas exogenamente administrado e C. elegans pequeno corpo transparente permite imagens dentro do animal intacto utilizando fluorescência de campo simples de largura. O principal desafio técnico na preparação da amostra é, portanto, de forma segura para imobilizar os animais. Há um número de diferentes técnicas usadas cada uma com vantagens e desvantagens. Usando um agente farmacológico para paralisar os animais é fácil de implementar e permite que a montagem de vários animais em uma preparação (Levamisole, um agonista colinérgico que provoca o tecido do músculo para aproveitar é tipicamente usado ^6). C. elegans pode também ser fisicamente imobilizado por montá-losna dura de agarose a 10% ^{7, 8.} Isto minimiza o impacto sobre a fisiologia do animal, permite que a longo prazo de imagens (horas) e recuperação de vários animais, mas é mais difícil tecnicamente. Ambas as técnicas de restringir o acesso físico para os animais (que se encontram sob uma lâmina de cobertura) e podem, portanto, ser utilizados apenas com certos estímulos experimentais (tais como a luz, a temperatura do campo eléctrico ou danos no laser). Para estímulos onde o acesso físico é necessário, como o toque ou a administração de produtos químicos, muitos estudos com sucesso colado C. elegans em vigor (usando cola grau veterinária) ^9. Isso é tecnicamente mais desafiador, é uma preparação único animal e não permitir a recuperação dos animais. Por fim, vários dispositivos têm sido utilizados microfluidicos que fisicamente conter C. elegans, preservando a fisiologia animal, permitindo que a exposição à maioria dos tipos de estímulos (dependendo da concepção do dispositivo) e pode permitir a troca rápida e recuperação dos animais <sup> 10, 11. Porém a microfluídica exigem habilidades técnicas adicionais e capacidades em fabricação, design e implementação. Em imobilizada actividade dos animais e de resposta a estímulos podem ser geralmente medidos em sensorial e interneurónios. Atividade dos neurônios motores requer técnicas mais sofisticadas para geração de imagens de animais em movimento. Aqui iremos apresentar métodos detalhados empregando as duas técnicas mais simples de paralisação e imobilização farmacológica com agarose dura.

Os métodos aqui apresentados podem ser usados ​​para medir a actividade neuronal e da fisiologia celular em C. elegans. Nós dar um exemplo de cada um: usando GCaMP para medir a resposta do neurônio sensorial ASJ a um campo elétrico externo, e usando cameleon para medir a resposta fisiológica de cálcio a danos de laser de um neurônio. Estes exemplos demonstram as vantagens e desvantagens dos dois tipos de fluoróforos e ilustram o que é possível com o sistema.