تقييم الظواهر الاعصاب في<em> ذبابة الفاكهة</em> الخلايا العصبية الدوبامين عن طريق تسلق فحوصات والجامعة المناعية الدماغ
Summary
نحن هنا وصف اثنين من المقايسات التي تم وضعها لدراسة تنكس عصبي التي تعتمد على سن الدوبامين (DA) الخلايا العصبية في<em> ذبابة الفاكهة</em>: تسلق / باغت السلبية الناجمة عن انجذاب بالجاذبية الفحص الذي يسمح لدراسة الآثار الفنية من DA الخلايا العصبية انحطاط والمناعية هيدروكسيلاز التيروزين الذي يستخدم لتحديد وإحصاء الخلايا العصبية DA كليا يتصاعد الدماغ.
Abstract
ذبابة الفاكهة السوداء البطن هو كائن نموذجا قيما لدراسة الشيخوخة والعمليات التنكسية المرضية في الجهاز العصبي. وتشمل مزايا الطاير كنظام تجريبي معرفة منشأ الجينية، فترة حياة قصيرة وإمكانية لمراقبة وتحليل كمي السلوكيات المعقدة. التعبير عن جينات مرض مرتبط في السكان العصبية محددة من الدماغ ذبابة الفاكهة، ويمكن استخدامها في تصميم نموذج لأمراض الاعصاب الإنسان مثل الشلل الرعاش والزهايمر 5.
الدوبامين (DA) الخلايا العصبية هي من بين السكان العصبية الأكثر ضعفا في الدماغ البشري الشيخوخة. في مرض باركنسون (PD)، واضطراب حركة الاعصاب الأكثر شيوعا، وتسارع فقدان الخلايا العصبية DA يؤدي إلى الانخفاض التدريجي الذي لا رجعة فيه في وظيفة الحركي. بالإضافة إلى العمر والتعرض للسموم البيئية، ويتفاقم فقدان الخلايا العصبية DA بواسطة الطفرات محددة في الترميزأو مناطق المروج من عدة جينات. تحديد هذه الأليلات PD المرتبطة يوفر أساس تجريبي لاستخدام ذبابة الفاكهة كنموذج لدراسة تنكس عصبي من الخلايا العصبية DA في الجسم الحي. على سبيل المثال، التعبير عن الجينات البشرية α-synuclein PD-مرتبط في ذبابة الفاكهة الخلايا العصبية DA يلخص بعض الملامح من الأمراض التي تصيب البشر، مثل الفقدان التدريجي للخلايا العصبية DA وانخفاض وظيفة الحركي 2. وفقا لذلك، وقد استخدم هذا النموذج بنجاح لتحديد الأهداف العلاجية المحتملة في PD 8.
نحن هنا وصف اثنين من المقايسات التي عادة استخدمت لدراسة تنكس عصبي التي تعتمد على عمر الخلايا العصبية DA في ذبابة الفاكهة: فحص التسلق على أساس جفل الناجم عن استجابة انجذاب بالجاذبية السلبية والتيروزين المناعية هيدروكسيلاز من الدماغ الكبار كله يتصاعد الى رصد عدد من الخلايا العصبية DA في أعمار مختلفة. في كلتا الحالتين، في التعبير المجراة من UAS رransgenes تحديدا في الخلايا العصبية DA يمكن تحقيقه باستخدام هيدروكسيلاز التيروزين (TH) المروج-GAL4 خط سائق 3، 10.
Introduction
خصوصية المقايسات وصفها هنا تعتمد على استخدام خط الطيران GAL4 الذي يستغل متواليات التنظيمية من الجين هيدروكسيلاز التيروزين لتحقيق التعبير معينة في الخلايا العصبية الدوبامين 3. هيدروكسيلاز التيروزين يحفز الخطوة الأولى ومعدل منظم للفي تركيب الدوبامين. مناعية TH في الكبار يتراكب الدماغ يطير مع أن الدوبامين، مما يجعل TH مرشح جيد لتحديد الخلايا العصبية DA في الجسم الحي (انظر على سبيل المثال 6). وعلاوة على ذلك، فإن نمط التعبير عن THGal4 هو أكثر تحديدا من ذلك من GAL4 خطوط أخرى مثل DdcGal4، والذي يحتوي على متواليات التنظيمية من الجين كربوكسيل دوبا ويدفع التعبير المعدلة وراثيا ليس فقط في الخلايا العصبية DA، ولكن أيضا في الخلايا العصبية سيروتونيني المفعول ومجموعات فرعية من الخلايا الدبقية 3 .
Feany وبندر (2000): لاحظ أولا أن التعبير عموم العصبية للإنسان الجين α-synuclein PD-مرتبط يسرع الفقدان التدريجي من ستاrtle التي يسببها السلوك انجذاب بالجاذبية السلبية في ذبابة الفاكهة. وقد لاحظنا نتائج مماثلة باستخدام الخلايا العصبية DA-محددة خط THGal4 لدفع expressionof إلى α-synuclein التحوير 10 وتستخدم هذه ظيفية للقراءة لدراسة دور اعصاب من مسار Nrf2 في هذا ذبابة الفاكهة نموذجا للPD 14. ويتم تكييف الفحص المحددة الموصوفة هنا من 2 و 3.
ذبابة الفاكهة الدماغ يحتوي على أكثر من 100 الخلايا العصبية DA، وترتيبها في لا يقل عن 5 مجموعات مختلفة (PPL1، PPL2، PAL، PPM1 / 2، PPM3) التي يمكن تصور كليا يتصاعد الدماغ عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر (انظر على سبيل المثال 11 و 7). انها لا تزال مثيرة للجدل سواء أو ليس عدد الخلايا العصبية DA في الانخفاض الدماغ ذبابة الفاكهة مع تقدم العمر 9 و 11، ولكن لوحظ تنكس عصبي التي تعتمد على العمر في الذباب حيث تم تحور الجينات PD-مرتبط / بإفراط (overexpressed) لنمذجة الأمراض التي تصيب الإنسان5. التعبير عن الإنسان α-DA synuclein في الخلايا العصبية لديها مثل هذا التأثير، وبالتالي، قد استخدمت كنموذج لPD. هنا نحن تصف مقايسة لالخلايا العصبية DA الاعتماد في الدماغ كله يتصاعد باستخدام TH كعلامة الخلية. وقد تم تكييف هذا الاختبار في الفترة من 13 و 10.
Protocol
Representative Results
Discussion
المقايسات الموصوفة هنا توفر نهجا مفيدا لدراسة دور الجينات المحددة، مما يشير إلى مسارات أو مركبات صغيرة في صيانة الخلايا العصبية DA في الشيخوخة، وكذلك في مختلف الخلفيات الوراثية المرتبطة بالمرض (استعرضت في 5).
وباغت التي يسب?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر ليو Pallanck للأسهم الطاير، كريستين سومرز للمساعدة التقنية وجيراسيموس P. Sykiotis لإجراء مناقشات مفيدة. وقد تم تمويل هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة تدريب منحة T32CA009363 إلى MCB
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) |
Materials Table.
References
- Bayersdorfer, F., Voigt, A., Schneuwly, J., Botella, Dopamine-dependent neurodegeneration in Drosophila models of familial and sporadic Parkinson’s disease. Neurobiol. Dis. 40, 113-119 (2010).
- Feany, M. B., Bender, W. W. A Drosophila model of Parkinson’s disease. Nature. 404, 394-398 (2000).
- Friggi-Grelin, F., Coulom, H., Meller, M., Gomez, D., Hirsh, J., Birman, S. Targeted gene expression in Drosophila dopaminergic cells using regulatory sequences from tyrosine hydroxylase. J. Neurobiol. 54, 618-627 (2003).
- Gargano, J. W., Martin, I., Bandari, P., Grotewiel, M. S. Rapid iterative negative geotaxis (RING): a new method for assessing age-related locomotor decline in Drosophila. Exp. Gerontol. 40, 386-395 (2005).
- Hirth, F. Drosophila melanogaster in the study of human neurodegeneration. CNS Neurol. Disord. Drug Targets. 9, 504-523 (2010).
- Lundell, M., Hirsh, J. Temporal and spacial development of serotonin and dopamine neurons in the Drosophila CNS. Dev. Biol. 165, 385-396 (1994).
- Mao, Z., Davis, R. L. Eight different types of dopaminergic neurons innervate the Drosophila mushroom body neuropil: anatomical and physiological heterogeneity. Front Neural Circuits. 3, 5 (2009).
- Mizuno, H., Fujikake, N., Wada, K., Nagai, Y. Alpha-Synuclein Transgenic Drosophila As a Model of Parkinson’s Disease and Related Synucleinopathies. Parkinsons Dis. 2011, 212706 (2011).
- Neckameyer, W. S., Woodrome, S., Holt, B., Mayer, A. Dopamine and senescence in Drosophila melanogaster. Neurobiol. Aging. 21, 145-152 (2000).
- Trinh, K., Moore, K., et al. Induction of the phase II detoxification pathway suppresses neuron loss in Drosophila models of Parkinson’s disease. J. Neurosci. 28, 465-472 (2008).
- White, K. E., Humphrey, D. M., Hirth, F. The dopaminergic system in the aging brain of Drosophila. Front Neurosci. 4, 205 (2010).
- Whitworth, A. J., Wes, P. D., Pallanck, L. J. Drosophila models pioneer a new approach to drug discovery for Parkinson’s disease. Drug Discov. Today. 11, 119-126 (2006).
- Wu, J. S., Luo, L. A protocol for dissecting Drosophila melanogaster brains for live imaging or immunostaining. Nat. Protoc. 1, 2110-2115 (2006).
- Barone, M. C., Sykiotis, G. P., Bohmann, D. Genetic activation of Nrf2 signaling is sufficient to ameliorate neurodegenerative phenotypes in a Drosophila model of Parkinson’s disease. Dis. Model Mech. 4 (5), 701-707 (2011).
