Évaluer phénotypes neurodégénératives en<em> Drosophila</em> Neurones dopaminergiques par des tests d'escalade et IMMUNOCOLORATION du cerveau entier
Summary
Nous décrivons ici deux essais qui ont été mis en place pour étudier la neurodégénérescence liée à l'âge des neurones dopaminergiques (DA) dans<em> Drosophila</em>: L'escalade / test de géotaxie négatif sursaut induite qui permet d'étudier les effets fonctionnels de neurones DA dégénérescence et l'immunomarquage de la tyrosine hydroxylase qui est utilisé pour identifier et compter les neurones dopaminergiques dans les montagnes entières du cerveau.
Abstract
Drosophila melanogaster est un organisme modèle précieux pour étudier le vieillissement et les processus pathologiques dégénératives du système nerveux. Les avantages de la mouche comme un système expérimental comprennent sa puissance de sa génétique, courte durée de vie et la possibilité d'observer et d'analyser quantitativement des comportements complexes. L'expression des gènes liés à la maladie dans les populations neuronales spécifiques du cerveau chez la drosophile, peut être utilisé pour modéliser les maladies neurodégénératives humaines telles que la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer 5.
Neurones dopaminergiques (DA) sont parmi les populations les plus vulnérables de neurones dans le cerveau humain vieillissement. Dans la maladie de Parkinson (PD), le trouble le plus fréquent neurodégénératif du mouvement, la perte accélérée des neurones DA entraîne une diminution progressive et irréversible de la fonction locomotrice. Outre l'âge et l'exposition à des toxines environnementales, la perte de neurones DA est exacerbée par des mutations spécifiques dans le codageou régions promotrices de plusieurs gènes. L'identification de ces allèles PD-associés fournit la base expérimentale pour l'utilisation de la drosophile comme modèle pour étudier la neurodégénérescence des neurones dopaminergiques in vivo. Par exemple, l'expression du gène α-synucléine humaine PD-lié chez la drosophile neurones DA reprend certaines caractéristiques de la maladie chez l'homme, par exemple la perte progressive des neurones dopaminergiques et déclin de la fonction locomotrice 2. En conséquence, ce modèle a été utilisé avec succès pour identifier des cibles thérapeutiques potentielles dans PD 8.
Nous décrivons ici deux essais qui ont été couramment utilisées pour étudier la neurodégénérescence liée à l'âge des neurones dopaminergiques chez la drosophile: un essai d'escalade basée sur la réponse de géotaxie négatif sursaut induite et immunomarquage de la tyrosine hydroxylase de tout le cerveau adulte monte sur surveiller le nombre de DA neurones à des âges différents. Dans les deux cas, l'expression in vivo du SAMU transgenes spécifiquement dans les neurones dopaminergiques peuvent être obtenus en utilisant une tyrosine hydroxylase (TH) promoteur Gal4 ligne de conducteur 3, 10.
Introduction
La spécificité des essais décrits ici repose sur l'utilisation d'une ligne à mouche Gal4 qui exploite les séquences régulatrices du gène de la tyrosine hydroxylase pour obtenir une expression spécifique dans les neurones dopaminergiques 3. Tyrosine hydroxylase catalyse la première et étape limitante dans la synthèse de la dopamine. immunoréactivité de TH dans les recouvrements du cerveau des mouches adultes avec celle de la dopamine, rendant TH un bon candidat pour identifier les neurones dopaminergiques in vivo (voir par exemple 6). En outre, le profil d'expression de THGal4 est plus spécifique que celle des autres Gal4 lignes telles que DdcGal4, qui contient des séquences régulatrices du gène de la dopa décarboxylase et conduit l'expression transgénique non seulement dans les neurones dopaminergiques, mais aussi dans les neurones sérotoninergiques et sous-ensembles de cellules gliales 3 .
Feany et Bender (2000) ont observé que la première expression pan-neuronal du gène α-synucléine humaine PD-lié accélère la perte progressive de la stacomportement de géotaxie négatif rtle induite chez la drosophile. Nous avons observé des résultats similaires en utilisant spécifique de la ligne DA-neurone THGal4 à conduire le ExpressionOf une α-synucléine transgène 10 et utilisé cette fonction de lecture d'étudier le rôle neuroprotecteur de la voie Nrf2 dans ce Drosophila modèle de PD 14. Le dosage spécifique décrit ici est adapté de 2 et 3.
Le cerveau Drosophila contient plus de 100 neurones dopaminergiques, disposés dans au moins 5 groupes différents (PPL1, pPL2, PAL, PPM1 / 2, PPM3) qui peuvent être visualisées dans les montagnes entières du cerveau par microscopie confocale (voir par exemple 11 et 7). Il est encore controversée si oui ou non le nombre de neurones dopaminergiques dans le cerveau diminue avec la drosophile âge de 9 ans, 11; toutefois, la neurodégénérescence liée à l'âge est observée chez les mouches où les gènes PD-linked ont été mutés / surexprimé pour modéliser les maladies humaines5. L'expression de l'α-synucléine humaine dans les neurones DA a un tel effet et, par conséquent, a été utilisé comme un modèle pour la maladie de Parkinson. Nous décrivons ici un essai de neurones dopaminergiques dans le cerveau entier comptent monte utilisant TH comme un marqueur de cellule. Ce test a été adapté à partir de 13 et 10 ans.
Protocol
Representative Results
Discussion
Les tests décrits ici de fournir une approche utile pour étudier le rôle des gènes spécifiques, les voies de signalisation ou de petits composés dans l'entretien des neurones dopaminergiques dans le vieillissement ainsi que dans différents fonds génétiques de maladies liées (revue en 5).
Le comportement de géotaxie négatif sursaut induite de la drosophile a été largement utilisé comme fonctionnel lecture de toutes les fonctionnalités de neurones dopami…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous remercions Leo Pallanck pour les stocks de mouche, Christine Sommers pour l'assistance technique et Gerasimos P. Sykiotis pour des discussions utiles. Ce travail a été financé par le NIH formation subvention T32CA009363 de MCB
Materials
| Name | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| Rabbit anti-tyrosine hydroxylase antibody | Millipore | AB152 | |
| Donkey TRITC-labeled anti rabbit IgG antibody | Jackson ImmunoResearch | 711-026-152 | |
| Mowiol | Calbiochem | 475904 | |
| DABCO | Sigma | D2522 | |
| Equipment | |||
| Polystyrene vials | VWR | 89092-734 | 28.5 x 95 mm |
| Digital camera | Canon | PowerShot A3100IS (model) | 12.1 Megapixels 4X Optical Zoom |
| Glass coverslips no. 1.5 | VWR | 48366 205 48393 252 | Sizes: 18 x 18 mm, 24 x 60 mm |
| Glass coverslips no. 2 | VWR | 48368-040 | Size: 18 x 18 mm |
| Dissection dishes | Electron Microscopy Sciences | 70543-01 | Size: 30 mm O.D. |
| Dumostar No. 5 tweezers | Electron Microscopy Sciences | 72705-01 | |
| Stereomicroscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 (model) | |
| Confocal microscope | Leica | SP2 or SP5 (model) |
Materials Table.
References
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